医源性产ESBLs耐热性大肠菌群及其耐药基因在水环境中的转归规律研究

摘要

本课题第一部分以重庆市某医院污水污染水环境中的耐热性大肠菌群为研究对象，对污水排放后所造成的水环境中菌群耐药性变化规律进行了研究。第二部分对产ESBLs耐热性大肠菌群进行筛选，对其质粒、基因组、耐药基因及其转移进行研究。第三部分在实验室条件下研究产ESBLs菌在不同水体中的生长规律，对其生存末期质粒、基因组和耐药基因变化情况进行研究，观察在不同作用时间和有效氯含量产ESBLs菌对氯制剂的抵抗力。实验方法1.以医院污水排放口为参照，分别采集排放口上游100m、排放口、下游150m、下游300m水样，每个点平行采集水样3份，每份500ml。采用0.415 μm孔径的滤膜进行样本的富集，滤膜置于m-FC培养基上37℃培养5h，44.5℃19h，将4个采样点的菌落通过滤膜法在m-FC培养基上进行计数。随机挑选上游100m10株，下游150m20株，下游300m 20株进行纯化培养。于2005年8-11月期间从该医院患者标本中分离大肠杆菌40株(尿液23株、痰及咽拭子12株、分泌物5株)，用．APILabPlus微生物分析系统、API20E试剂盒进行菌种鉴定，选用氨苄西林、庆大霉素、丁胺卡那霉素、环丙沙星、氯霉素、头孢噻肟、头孢他啶、氨曲南、亚胺培南、头孢曲松、头孢泊肟等11种常用抗生素进行药敏实验(Kirby-Bauer法)。 2．根据CLS12005标准筛选产ESBLs菌，采用质粒抽提盒和基因组抽提盒进行质粒和基因组的抽提。设计国内常见3种产ESBLs菌耐药基因引物(TEM、CTX-M、SHV)以11株产ESBLs菌的质粒为模板进行PCR，产物进行凝胶电泳。选用GC含量50-80％的随机引物对基因组进行RAPD(随机引物扩增)分析，筛选适宜的引物，将11株菌进行基因分型。以产ESBLs菌为供体菌(头孢噻肟抗性，m-FC培养基上呈现蓝色)，非产ESBLs菌为受体菌(头孢噻肟敏感，m-FC培养基上呈现黄色)，LB液为培养介质，含头孢噻肟60μg/ml的m-FC培养基作为鉴别培养基，进行耐药基因的转移实验。 3．选用33号菌作为产ESBLs菌的代表，设计5种水体观察其生存情况，5种水体依次为：灭菌河水、未灭菌河水、灭菌蒸馏水、灭菌自来水、未灭菌自来水。在加入菌后2h，6h，12h，24h，1.5天，2天，2.5天，3天，3.5天，以后每隔24h，一直到47天，滤膜法计数33号菌。至33号菌在各水体的生存末期，提取质粒和基因组，比较质粒条带变化，通过RAPD比较基因组的变化，同时进行33号菌固有的耐药基因PCR。利用正交设计助手Ⅱ 3.1V软件进行3因素(温度、pH值、颗粒物)3水平(温度：15℃、25℃、35℃；pH值：6.7、7.2、7.5；颗粒物：1mg/100ml、2 mg/100ml、3 mR/100ml)设计，于1、2、4、6、8、10、15天滤膜法计数9种水样的细菌数。氯消毒法首先用简易定量滴定法和余氯测定计法对优氯净有效氯含量进行测定，按照消毒技术规范2002版规定，采用悬液定量鉴定实验进行杀菌实验。配制有效氯含量依次为0.4.、0.8、1.2、2.4.、3.2、4mg/L的溶液，加入33号菌液至终浓度为1×10<'4>-1×10<'5>CFU/ml，于1、5、10、30、50min分别进行菌落计数(滤膜法)和游离氯含量测定(余氯测定计)。实验结果1.医院污水污染水环境中分离得到的50株耐热性大肠菌群中，大肠埃希菌为优势菌，占82％。医院污水排放后造成水环境中耐热性大肠菌群绝对数量由0.72×10<'9>/100ml增加至1.71×10<'9>/100ml(P<0.05)'，其百分率由42％增加到66％(P<0.05)。与排放口上游比较，其耐药性升高较为显著的为氨苄西林(P<0.01)，环丙沙星、庆大霉素、氯霉素、氨曲南、头孢曲松、头孢噻肟(P<0.05)，多重耐药率由0上升到50％。临床分离的大肠埃希菌与该水环境的耐热性大肠菌群对抗生素的耐药率相关性良好(r=0.943，P<0.01)，前者耐药率高于后者。 2.该环境分离到的11株产ESBLs菌(22％)与非产ESBLs菌比较，环丙沙星、头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢泊肟的耐药率上显著升高(P<0.01)。11株产ESBLs菌有10株携带片断大小介于1，375bp到21，226bp之间的质粒，其耐药基因分型以TEM-1型为主(6株)，CTX-M(2株)和SHV型(1株)为辅，33、34号菌株同时具有TEM型和CTX-M型，有4株菌属于这3种型以外的型别。GC含量为60％的随机引物能够将11株菌分为10种基因型。TEM耐药基因能够以接合的方式从产ESBLs大肠埃希菌转移到房峰哈夫尼菌，其转移率为8.21×10<'-4>。 3.33号菌在5中水体中生存时间由长到短依次为：灭菌河水>未灭菌河水>灭菌蒸馏水>灭菌自来水>未灭菌自来水，生存时间最短的为未灭菌自来水(3天)，最长的为灭菌河水，在47天菌落数仍然维持在10<'6>CFU/ml左右。灭菌河水和未灭菌河水生长曲线包括4个时相点：适应期、对数生长期、平台期、衰亡期；灭菌蒸馏水、灭菌自来水和未灭菌自来水仅包括适应期和衰亡期。33号菌在各水体生存末期质粒、基因组及耐药基因特点为：未灭菌河水和灭菌蒸馏水中的33号菌质粒和基因组图谱与原代菌株一致，但灭菌河水、灭菌自来水和自来水中33号菌质粒图谱在2027bp和3000bp左右明显多出两条条带，在1200bp左右缺少1条条带，基因组图谱在1，000bp和低于500bp处出现1条条带，在600bp处缺少1条条带，33号菌所携带的TEM和CTX-M耐药基因在生存末期仍然稳定检出。三水平三因素正交实验结果为：除第1天pH值在三因素中对细菌生长影响最大以外，其余检测时间结果均为温度影响作用最大，颗粒物影响作用最小。游离氯(Y)和有效氯含量(X)的一元线性回归方程为：Y=-0.293+0.714X(R<'2>=0.995，P=0.000<0.01)；以杀菌率(Y)为因变量，有效氯含量(X<,1>)和作用时间(X2)为自变量，建立多元线性回归方程Y=O.508+0.097Xl+0.013XE(R<'2>=0.709，P=0.000<0.05)。根据公式推导，当有效氯含量为1.05mg/L，即游离氯量为0.46mg/L时，作用30min，对33号菌能够有效杀灭。按照现有的标准，出厂水所要求的游离氯含量(0.3mg/L)杀灭率为97.9％，对于管网水所出现的二次污染，管网末梢水中游离氯含量0.05mg/L更不足以满足杀菌要求(杀灭率为94.5％)。 结论：1.医院污水排放入水环境后造成耐热性大肠菌群绝对数量和相对数量的升高，其耐药谱具有以β-内酰胺酶抗性为主，多重耐药率高(50％)的特点；医院污水排放可能是造成该水环境中微生物耐药性增加的主要原因。 2.医院排放污水污染水环境中的产ESBLs菌比例较高(22％)，具有多重耐药，耐药率及质粒携带率高的特点，耐药基因分型以TEM型为主；RAPD技术能够快速有效地对水环境中产。ESBLs菌进行基因分型(11株菌分为10种亚型)，并能运用于水体中耐药菌株的同源性分析。产ESBLs菌的耐药基因能够在不同菌之间发生转移。 3.33号菌通过调节自身质粒和基因组水平的变化，能够在多种水体中生长繁殖，以河水最适，自来水最差。耐药基因在各水体的生长末期均非常稳定。温度对细菌生长影响最大，pH值其次，颗粒物影响最小。若该环境中的产ESBLs菌(10<'4>CFU/ml左右1污染管网水系统时，在有效氯含量为1.05mg/L，即游离氯量为0.46mg/L时，作用30min，对33号菌能够有效杀灭。按照现有的标准，出厂水所要求的游离氯含量(0.3mg/L)杀灭率为97.9％，对于管网水所出现的二次污染，游离氯含量0.05mg/L更不足以满足杀菌要求(杀灭率为94.5％)，应适当延长作用时间或提高余氯含量。

目录

论文说明：英文缩写一览表

声明

摘要

前言

第一部分医院污水污染水环境中耐热性大肠菌群的耐药谱分析

实验材料

实验方法

结果

讨 论

小 结

第二部分医院污水污染水环境中产ESBLs耐热性大肠菌群分子水平特点及耐药基因转移研究

实验材料

实验方法

实验结果

讨 论

小 结

第三部分水环境因素对产ESBLs菌生存影响的实验研究

实验材料

实验方法

结果

讨 论

小 结

全文结论

致 谢

参考文献

文献综述水环境中耐药菌的研究现状

攻读硕士学位期间撰写的论文