MNNG对人正常胃黏膜上皮细胞端粒酶活性影响及其甲基化调控机制分析

摘要

N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)是一种诱变剂，通过MNNG饮用水或直接灌胃可诱导出胃癌，但其具体致癌机制及对机体有无其它作用至今仍不清楚。近年来不管是基础科研还是临床实践，人们都发现诱变剂并不象传统认识的仅仅具有致癌作用，它们除了干扰细胞代谢、畸变染色体外，还可以抑制细胞增生、诱导细胞凋亡、提高免疫功能，因此，诱变剂对机体的作用是复杂的，除了长期以来形成的单一致癌认识外，也许还有不为我们所知的其它作用。端粒酶是一种核糖核蛋白，与细胞癌变密切相关，有学者报道85％～90％的癌细胞端粒酶表达阳性。在端粒酶3种结构成分中，其逆转录酶(hTERT)最为关键，是端粒酶表达的限速酶，二者呈正相关，而在hTERT转录表达过程中，其基因启动子区是否发生甲基化又是一个重要的调控因素，对hTERT表达与否起重要作用。 鉴于以上认识，本课题采用原代培养人正常胃黏膜上皮细胞，观察MNNG对其端粒酶活性和hTERT表达影响，并对干预后hTERT基因启动子区进行甲基化分析，以了解MNNG干预后人正常胃黏膜上皮细胞端粒酶活性变化及引起这种变化的机制，以期为MNNG致胃癌机制的进一步研究提供实验依据，为MNNG对机体的全面作用研究打下一定基础。实验方法和结果如下： 一、成人正常胃黏膜上皮细胞的分离、培养及鉴定 磁性搅拌酶分离法培养成人正常胃黏膜上皮细胞。细胞活力在第4d达到最高点，BrdU孵育有33-3％的细胞处于细胞周期S期和曾经处于S期：接种密度高时细胞PAS反应都呈阳性，培养3天大部分细胞CK-18阳性；透射电镜可见细胞微绒毛、分泌颗粒、连接复合体等上皮细胞特征。 二、MNNG对人正常胃黏膜上皮细胞端粒酶活性和hTERT表达影响 采用端粒重复序列扩增法(TRAP)检测MNNG干预后人正常胃黏膜上皮细胞端粒酶活性，半定量反转录-聚合酶链式反应、westernblot和免疫细胞化学检测hTERT表达水平，发现原代培养人正常胃黏膜上皮细胞同癌细胞一样表达端粒酶，MNNG干预结果也与习惯认识不同，不但不增强端粒酶活性，6.8uM和68uM两个浓度组都使细胞端粒酶活性下降。MNNG干预后hTERTmRNA和hTERT蛋白表达变化与端粒酶变化一致。 三、MNNG干预后人正常胃黏膜上皮细胞hTERT基因启动子区甲基化分析 采用甲基化特异性PCR(MSP)和亚硫酸氢钠修饰测序(BSP)两种方法检测hTERT基因启动子区甲基化状态，发现未干预人正常胃黏膜上皮细胞同癌细胞一样hTERT基因启动子区CpG全部甲基化，MNNG干预后大部分CpG去甲基化。所检测靶序列中含两个髓样特异性锌指蛋白-2(MZF-2)结合基序，甲基化可以阻碍MZF-2转录因子与其DNA基序的结合。 以上结果提示：1、磁性搅拌酶消化法是一种简单可靠的胃黏膜上皮细胞原代培养方法，所得细胞从数量和纯度上能满足一般实验要求。2、正常细胞多检测不到端粒酶活性，但原代培养人正常胃黏膜上皮细胞表达端粒酶且其活性与SGC-7901癌细胞株相似；hTERT表达亦如此。MNNG对二者的表达都有抑制作用。3、hTERT基因表达与其启动子区甲基化成正相关，MNNG对人正常胃黏膜上皮细胞hTERT启动子区具有去甲基化作用，其对端粒酶和hTERT的表达抑制可能通过这种去甲基化机制实现。4、甲基化可以通过抑制转录因子结合活性实现表达调控，MZF-2是一种负调控转录因子，MNNG干预后其结合基序附近CpG位点发生去甲基化，可能使MZF-2结合活性增强，因此MZF-2可能参与了由去甲基化介导的端粒酶和hTERT表达抑制。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写一览表

声明

前 言

第一部分 成人正常胃黏膜上皮细胞的分离、培养及鉴定

材料与方法

结 果

讨 论

第二部分 MNNG对人正常胃黏膜上皮细胞端粒酶活性和hTERT表达影响

材料与方法

结 果

讨 论

第三部分 MNNG干预后人正常胃黏膜上皮细胞hTERT基因启动子区甲基化分析

材料与方法

结 果

讨 论

全文小结

致 谢

附录 PCR产物克隆PUCm-T载体简介

参考文献

文献综述一 正常胃黏膜上皮细胞的原代培养

文献综述二 基因甲基化研究现状概述

在读期间发表的文章

The Effects of MNNG on the Telomerase of human Gastric Epithelium Resulting from Methylation Regulation