编码鼠CD20腺病毒载体感染的树突状细胞诱导抗小鼠淋巴瘤免疫

摘要

背景和目的： CD20阳性的B细胞淋巴瘤是临床上恶性淋巴瘤的最常见类型，目前免疫治疗在淋巴瘤的治疗中占有显著的地位。利妥昔单抗(Rituximab，美罗华)在临床上的应用显著地改善了CD20+的B细胞淋巴瘤患者的预后。但美罗华单抗在体内产生的是被动免疫，而在抗肿瘤免疫中，主要还是以主动性的细胞免疫为主。刺激患者机体产生针对淋巴瘤细胞的细胞免疫反应，或同时刺激产生细胞和体液免疫反应是淋巴瘤免疫治疗的重要研究方向之一。 继手术、放疗和化疗之后，生物治疗已成为肿瘤治疗的重要手段之一。树突状细胞(Dendriticcells，DCs)是目前体内免疫系统中功能最强的抗原呈递细胞(antigenpresentingcell，APC)，以DC为基础的肿瘤疫苗已成为当前肿瘤免疫治疗的一个重要策略。在诱发肿瘤特异性细胞免疫反应方面，树突状细胞(DC)起着关键性的作用，而以腺病毒为载体将目的抗原转送至DC中可大大提高DC的抗原提呈及诱导机体产生对该抗原特异性免疫反应的效率。 本研究探讨编码小鼠CD20的腺病毒载体Ad5/35修饰的DC诱导小鼠CD20+淋巴瘤的肿瘤特异性免疫，评价其对CD20+淋巴瘤细胞的免疫保护作用，为临床免疫治疗CD20+淋巴瘤提供一条新的思路和实验依据。 方法： 1.建立稳定表达鼠CD20的肿瘤细胞株：将pcDNA3.1mCD20/EGFP质粒用脂质体包裹后转染至B16.F10小鼠肿瘤细胞中，经G418筛选，以EGFP(增强型免疫荧光蛋白)作为报告基因,用流式细胞仪进行分选，最终获得B16.F10mCD20/EGFP细胞株。 2.细胞毒实验：实验分2组，每组3只小鼠：实验组(Ad5/35mCD20感染DCs组)；对照组(空载腺病毒dl70-3感染DCs组)。J下常小鼠DC培养的第7天，将Ad5/35mCD20及dl70-3以100pfu/DC的浓度与DC共同孵育4小时，收集。DCs，计数，调整DCs数为5x105/200ul。按每只小鼠5x105/200μlDCs皮内注射至小鼠左后腿上部背侧免疫小鼠，一周后杀小鼠取脾脏进行CTL细胞毒杀伤实验。以B16.F10mCD20/EGFP细胞作为靶细胞，免疫后小鼠脾细胞作为效应细胞，用3个效靶比(E:T)100:1、50:1和25:1，用乳酸脱氢酶释放实验检测CTL杀伤率。 3.体内荷瘤实验：取C57BL/6小鼠20只，4-6N(18±2)g，雌性，随机分为两组，实验组(Ad5/35mCD20感染DCs免疫1次，10只)，对照组(dl70-3感染DCs免疫1次，10只)。具体免疫方法同细胞毒实验。免疫1周后，以生理盐水调整B16.F10mCD20/EGFP细胞浓度为2x105个/200μl，按每只小鼠2x105B16.F10mCD20/EGFP细胞小鼠右后腿上部背侧皮下接种。接种后前14天隔日观察，14天后每日观察小鼠成瘤情况，此时尚未成瘤的小鼠继续观察至两个月。 结果： 1.用G418筛选及流式细胞仪分选技术相结合的方法可获得稳定表达mCD20的B16.F10mCD20/EGFP肿瘤细胞株，流式细胞仪检测99.1％的细胞表达EGFP，99.7％表达mCD20。 2.体外细胞毒性T淋巴细胞杀伤实验：在效靶比为100:1、50:1和25:1情况下，实验组的杀伤率分别为63.83±7.72％，(t=15.33，P＜0.01)、47.70±5.31％(t=14.23，P＜0.01)和22.73±3.11％(t=8.74，P＜0.01)，对照组的杀伤率分别为15.37±0.80％、12.83±2.84％和11.10±1.01％。实验结果有统计学意义。 3.荷瘤实验：对照组小鼠在接种2x105细胞的B16.F10mCD20/EGFP细胞后16至18d内全部有肿瘤生长，实验组仅于18d(1只)、20d(2只)、24d(1只)共有4只小鼠成瘤，且肿瘤体积小于对照组。实验组其余小鼠继续观察至2个月，仍未见肿瘤生长。对照组成瘤率为100％，实验组为40％，两组间成瘤率有显著性差异(x2=8.57，P＜0.01)。提示Ad5/35mCD20能产生抗小鼠淋巴瘤的特异性免疫，对CD20+的淋巴瘤小鼠有免疫保护作用。 结论： Ad5/35mCD20免疫小鼠能诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的产生，其CTL杀伤率与效靶比有关；Ad5/35mCD20能产生抗小鼠淋巴瘤的特异性免疫，对CD20+的淋巴瘤小鼠有免疫保护作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写一览表

声明

前 言

第一部分B16.F10 mCD20/EGFP肿瘤细胞模型的构建

材料与方法

结 果

讨 论

第二部分体外细胞毒性T淋巴细胞杀伤实验及体内荷瘤实验

实验设计

材料与方法

结 果

讨 论

全文总结

致 谢

参考文献

文献综述：DC和肿瘤的免疫治疗

硕士研究生阶段发表论文