CCR7基因转染小鼠未成熟树突状细胞诱导皮肤移植免疫耐受的研究

摘要

研究背景及研究目的
　　 本研究拟通过构建含有小鼠CCR7的重组腺病毒,尝试在imDCs上建立CCR7的表达,使imDCs获得原本mDCs才具有的高效迁移能力,避免imDCs在外周组织向成熟状态的分化,有效地确保其诱导免疫耐受功能的发挥,为临床上大面积深度烧伤患者早期创面覆盖引起的免疫排斥提供新的解决方法和思路。
　　 研究方法
　　 1、小鼠骨髓源树突状细胞的培养及鉴定
　　 小剂量rmGM-CSF和rmIL-4联合体外诱导培养BALB/c小鼠骨髓来源的imDCs,第5天收获得到一定数量的imDCs,加入rmTNF-α刺激细胞成熟而获得mDCs。通过光学显微镜及扫描电镜观察细胞的形态学变化,应用流式细胞仪检测细胞表面标志分子的表达水平。
　　 2、CCR7基因转染小鼠骨髓源未成熟树突状细胞及其功能鉴定
　　 采用梯度离心法将Ad空载体和Ad-ccr7腺病毒转染入imDCs,通过光学显微镜和扫描电镜来观察细胞形态学上的变化,应用流式细胞仪检测细胞表面的相应标志物,从而来观察Ad-ccr7腺病毒转染对小鼠骨髓源imDCs的成熟状态及形态的影响。采用Real-time PCR法、细胞免疫荧光法、Western Blot法检测Ad-ccr7腺病毒转染前后小鼠骨髓源树突状细胞CCR7mRNA及蛋白水平的表达变化。通过体外趋化试验和混合淋巴细胞反应比较观察Ad-ccr7腺病毒转染前后小鼠骨髓源DCs的体外迁移能力和体外刺激T淋巴细胞增殖能力。
　　 3、CCR7基因转染imDCs对小鼠异基因皮肤移植的影响
　　 在小鼠异基因皮肤移植实验中,我们将供者源imDCs、供者源mDCs、供者源imDCs+Ad、供者源imDCs+Ad-ccr7和供者源imDCs+Ad-ccr7+IL-10通过腹腔注射入受体小鼠体内,观察各组细胞对小鼠异基因移植皮片存活状况的影响,并通过组织学检查观察移植皮片的结构改变。
　　 实验结果
　　 1、小鼠骨髓源DCs的培养及鉴定结果
　　 体外培养的DCs经光学显微镜及扫描电镜观察发现:imDCs表面光滑,凹凸不平,毛刺状突起较少,而mDEs表面伸出许多较长的树枝样突起,突起长短不一,形态各异。流式细胞仪检测发现在imDCs中CD11c、CD80、CD83、MHCⅡ的阳性率分别为24.7％、9.4％、20.5％和20.5％,而在mDCs中CD11c、CD80、CD83、MHCⅡ的阳性率分别为86.5％、88.4％、76.9％和92.4％。这表明体外培养的DCs符合其典型形态学特征和表面标志水平。
　　 2、CCR7基因转染对小鼠骨髓源imDCs的影响
　　 2.1采用高速离心法将Ad-ccr7腺病毒转染入小鼠骨髓源imDCs内,其感染效率在MOI达到100时约有70％左右。在扫描电镜中可见imDCs转染腺病毒空载体和Ad-ccr7后,细胞形态不规则,表面粗糙,细胞表面的不规则膜性树枝状突起较未转染imDCs增多,而IL-10组细胞膜表面不规则突起明显减少,这说明IL-10可一定程度地抑NimDCs的成熟。小鼠骨髓源imDCs经腺病毒转染2天后,流式细胞术检测发现imDCs+Ad组细胞中CD11c、CD80、CD83、MHCⅡ的阳性率分别为40.0％、27.7％、28.5％和37.8％。imDCs+Ad-ccr7组细胞中CD11c、CD80、CD83、MHCⅡ的阳性率分别为37.8％、27.4％、21.3％和37.0％,而imDCs+Ad-ccr7+IL-10组细胞中CD11c、CD80、CD83、MHCⅡ的阳性率分别为20.5％、15.5％、21.6％和32.9％。这表明转染Ad空载体和Ad-ccr7腺病毒可促使imDCs表面标志略微升高,即向成熟方向发展,但加入细胞因子IL-10可略微下调这些表面标志的表达,在一定程度上抑制imDCs的成熟。
　　 2.2 Real-time PCR结果显示,imDCs中CCR7mRNA水平较低,mDCs中CCR7mRNA含量是imDCs的1.544倍。imDCs转染Ad空载体后,其CCR7mRNA含量是imDCs的1.115倍,imDCs转染Ad-ccr7腺病毒后,其CCR7mRNA含量是imDCs的2.941倍,而IL-10组中CCR7mRNA含量为imDCs的1.556倍,接近正常mDCs含量。这也说明Ad-ccr7腺病毒转染可以明显增加未成熟树突状细胞CCR7mRNA水平的表达,同时IL-10在一定程度上可以抑制转染过程中imDCs的成熟。
　　 2.3细胞免疫荧光结果显示imDCs和imDCs+Ad组细胞不表达CCR7,而mDCs细胞可表达CCR7。imDCs转染Ad-ccr7腺病毒后CCR7的表达增加,说明CCR7基因有效转入imDCs并表达蛋白。Western Blot结果通过Qulitity One软件分析显示:imDCs、imDCs+Ad、imDCs+Ad-ccr7、imDCs+Ad-ccr7+IL-10和mDCs中CCR7蛋白表达的相对含量分别为0.09、0.15、0.96、0.46和0.35。结果表明,imDCs和imDCs+Ad组中CCR7在蛋白水平几乎不表达,而转染Ad-ccr7腺病毒后imDCs的CCR7蛋白含量明显上升,其蛋白相对含量可以高于正常mDCs的含量。加入IL-10可以抑制imDCs朝成熟方向转化,但是其CCR7蛋白的表达含量仍可以达到mDCs的水平。
　　 2.4体外迁移实验结果表明imDCs细胞的体外趋化迁移率均低于5％,而mDCs、imDCs+Ad-ccr7、imDCs+Ad-ccr7+IL-10组细胞在CCL19作用下体外趋化迁移率均较imDCs组明显上升。而CCL19+anti-CCR7mAb组,在CCL19对抗剂anti-CCR7mAb作用下迁移率均有下降,但仍高于各自的空白组。这表明能够表达CCR7蛋白的转染病毒后imDCs及mDCs可在其配体CCL19的作用下增强体外迁移能力,同时anti-CCR7mAb可以在体外部分的拮抗其配体CCL19的作用。
　　 2.5混合淋巴细胞反应结果表明,imDCs以1:5比率与同种异体未致敏T淋巴细胞混合后imDCs组刺激T淋巴细胞增殖能力较弱,刺激指数为1.6±0.1,而mDCs组刺激T淋巴细胞增殖能力明显增强,刺激指数为5.6±0.3。腺病毒转染后细胞刺激T细胞增殖的能力较imDCs组增强但是弱于mDCs组,刺激指数分别为3.4±0.2和3.1±0.2,但是加入IL10可以明显降低刺激能力,刺激指数为1.8±0.1。表明腺病毒转染可部分增强imDCs的刺激增殖能力,但还是弱于mDCs,IL-10可抑制其促增殖能力。
　　 3、CCR7基因转染imDCs对小鼠异基因移植皮片的影响
　　 3.1通过与对照组(NS)相比较,供者源imDCs、供者源imDCs+Ad-ccr7、供者源imDCs+Ad-ccr7+IL-10组皮肤移植物的MST均明显延长,而供者源mDCs和imDCs+Ad组MST与对照组相比无显著性差异,说明单纯使用供者源mDCs对移植皮片的存活无明显影响,但供者源未成熟DC的应用可延长皮片的存活时间。同时,供者源imDCs+Ad-ccr7+IL-10组MST较供者源imDCs组显著延长,而供者源imDCs+Ad-ccr7组MST较供者源imDCs组差异不明显,显示供者源imDCs在转染腺病毒Ad-ccr7后,其诱导免疫耐受的能力较转染前提高,加入IL-10更能够显著提高皮片存活的时间。
　　 3.2组织切片活检显示皮肤组织结构较清楚,纤维组织结构排列有序,成纤维细胞多,真皮层内血管腔丰富,结构完整,大小不一,局部有炎性细胞浸润。表明皮片生长情况良好,白细胞的趋化功能正常。
　　 结论
　　 1、小鼠骨髓来源细胞在应用低剂量rmGM-CSF和rmIL-4联合刺激诱导后获得具有典型形态特征的imDCs和mDCs。
　　 2、Ad-ccr7腺病毒成功转染入小鼠骨髓源imDCs内。转染后小鼠imDCs在形态学及细胞表面标志分子上可向成熟状态分化,但IL-10可一定程度地抑制imDCs的成熟。
　　 3、Real-time PCR结果表明Ad-ccr7腺病毒转染可以明显增加未成熟树突状细胞CCR7mRNA水平的表达,同时IL-10在一定程度上可以抑制转染过程中imDCs的成熟。
　　 4、细胞免疫荧光及Western Blot结果表明,转染Ad-ccr7腺病毒后imDCs的CCR7蛋白含量明显上升。加入IL-10可以抑制imDCs朝成熟方向分化,但其CCR7蛋白的表达含量仍可以达到mDCs的水平。
　　 5、体外迁移实验表明imDCs细胞的体外趋化迁移率均较低,而转染Ad-ccr7腺病毒后imDCs在CCL19作用下体外趋化迁移率均较imDCs组明显上升。同时anti-CCR7mAb可以在体外部分的拮抗其配体CCL19的作用。
　　 6、混合淋巴细胞反应实验显示imDCs组刺激T淋巴细胞增殖能力较弱,而mDCs组刺激T淋巴细胞增殖能力明显增强。Ad-ccr7腺病毒转染后其刺激T细胞增殖的能力较imDCs组增强但是弱于mDCs组,加入IL-10可以明显降低刺激能力。
　　 7、小鼠异基因皮肤移植实验表明,单纯使用供者源mDCs对移植皮片的存活无明显影响,供者源imDCs在转染Ad-ccr7腺病毒后可明显延长皮片的存活时间,加入IL-10更能够显著提高皮片存活的时间。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写一览表

前言

第一部分 CCR7基因转染对小鼠未成熟树突状细胞成熟及迁移功能的影响

分题一 小鼠骨髓源树突状细胞的培养及鉴定

材料与方法

结果

讨论

分题二 CCR7基因转染小鼠骨髓源未成熟树突状细胞及其功能鉴定

材料与方法

结果

讨论

第二部分 CCR7基因转染小鼠未成熟树突状细胞对异基因皮肤移植免疫耐受的影响

材料与方法

结果

讨论

全文结论

致谢

照片

参考文献

文献综述 健康与疾病状态下树突状细胞的亚型分类及其作用

博士研究生在读期间发表论文

英文论著