CCR7基因修饰未成熟树突状细胞诱导大鼠高危角膜移植免疫耐受的研究

摘要

目的：体外培养和诱导供体大鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞（immature dendritic cell，imDC），使用趋化因子受体7(chemokine receptor7，CCR7)基因重组腺病毒体外转染imDC，研究其对大鼠同种异体高危角膜移植免疫排斥反应的影响，探讨其诱导免疫耐受的机制。
　　方法：通过联合应用重组大鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）和白细胞介素（Interleukin，IL）-4体外培养、诱导、扩增大量的imDC，通过细胞形态及表型对其加以鉴定；将携带大鼠CCR7基因的重组腺病毒通过增强离心法转染imDC，对转染后的imDC再次进行形态及表型鉴定，并通过细胞免疫荧光检测CCR7的表达；以60只SD大鼠作为受体，30只Wistar大鼠作为供体，通过碱烧伤建立高危角膜移植模型；采用随机数字表法将受体SD大鼠分为空白对照组、未修饰imDC组（imDC组）、imDC+空载体腺病毒组(imDC+Ad组)和 imDC+CCR7腺病毒组(imDC+Ad-CCR7组)，每组各15只；各组受体术前7d和术后3d分别经尾静脉注入PBS液、供体来源的未修饰imDC、空载体腺病毒转染后的imDC和携带CCR7基因的腺病毒转染后的imDC(1×107个/只，细胞悬浮于0.1ml PBS液中，空白对照组只注入等量PBS液)；术后每日在裂隙灯下观察角膜植片的存活情况并评分，术后14d每组随机处死6只受体大鼠，取角膜植片行HE切片观察以及通过RT-PCR检测Th1型细胞因子IL-2、干扰素-γ（interferonγ，IFN-γ）和Th2型细胞因子IL-4、IL-10的mRNA表达水平。
　　结果：培养的imDC经过倒置相差显微镜及扫描电镜的形态学观察、流式细胞仪进行的免疫学表型检测，可证实为实验所需的imDC；细胞免疫荧光显示imDC不表达CCR7，imDC经空载体腺病毒转染后不表达CCR7,经CCR7腺病毒转染后CCR7表达增加；角膜移植术后，imDC+Ad-CCR7组大鼠角膜植片的混浊、水肿及新生血管程度评分较其他组均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；角膜植片平均存活时间（MST）：imDC+Ad-CCR7组较对照组、imDC组和imDC+Ad组显著延长，差异有统计学意义(P<0.05)；角膜HE切片显示，imDC+Ad-CCR7组植片轻度水肿、基质层板层纤维排列有序，imDC组和imDC+Ad组呈不同程度水肿，基质层板层纤维排列轻度紊乱、有少量的炎性细胞；空白对照组的植片高度水肿、角膜基质板层纤维紊乱，出现大量炎性细胞和新生血管；RT-PCR显示：imDC+Ad-CCR7组Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2 mRNA的表达较对照组、imDC组和imDC+Ad组明显降低；Th2型细胞因子IL-4、IL-10 mRNA的表达明显升高，差异有统计学意义（均为P<0.05）。
　　结论：通过腺病毒增强离心法转染imDC可使CCR7基因有效转入imDC并表达CCR7蛋白；通过静脉输注供体骨髓来源的经CCR7基因修饰的imDC可以有效抑制高危角膜移植免疫排斥反应，诱导免疫耐受，延长植片的存活时间；经CCR7基因修饰的imDC可能主要通过诱导Th1/Th2偏移参与诱导高危角膜移植免疫耐受。

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前言

技术路线图

材料与方法

1材料

1.1 实验动物

1.2 主要试剂和实验仪器

1.3 相关试剂的配制

2 实验方法

2.1 动物分组及处理

2.2 大鼠骨髓源DC的分离培养及扩增

2.3 imDC的鉴定

2.4 携带大鼠CCR7基因的重组腺病毒转染imDC预实验：

2.5 携带大鼠CCR7基因的重组腺病毒转染imDC：

2.6 转染后imDC的鉴定

2.7 大鼠高危角膜移植模型的建立

2.8 大鼠同种异体角膜移植术

2.9 术后观察及评分标准

2.10 排除标准

2.11 角膜植片病理组织学观察

2.12 RT-PCR检测植片Th1型细胞因子白细胞介素（Interleukin，IL）-2、干扰素-γ（interferon，IFN-γ）和Th2型细胞因子IL-4、IL-10的mRNA表达水平

2.13 统计学方法

结果

1 倒置相差显微镜下imDC的形态观察

2 扫描电镜下imDC的形态观察

3 流式细胞仪检测imDC的免疫表型

4细胞免疫荧光检测CCR7的表达

5 碱烧伤后角膜新生血管的形态学观察

6 角膜移植术后植片排斥反应情况观察

7 各组大鼠角膜炎症评分

8 HE染色

9 RT-PCR检测IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10 mRNA的表达

讨论

1供体骨髓来源imDC的体外培养与鉴定

2 CCR7基因重组腺病毒转染imDC及其鉴定

3 CCR7基因修饰的imDC在同种异体高危角膜移植免疫排斥反应中的作用

4CCR7基因修饰的imDC诱导Th1/Th2偏移抑制大鼠高危角膜移植免疫排斥反应

结论

参考文献

附图

综述

致谢

作 者 简 介

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