人肠三叶因子启动子的克隆及转录活性分析

摘要

研究背景:肠三叶因子(intestinal trefoil factor,ITF)是含有59个氨基酸残基的单链多肽[1],分子量为6.7kD,其核心的38～39个氨基酸残基中包含6个半胱氨酸,形成3对链内二硫键,产生特征性三叶形结构,并因此而得名[10]。研究表明,ITF是具有潜在药用价值的小分子多肽,能减轻各种致伤因素导致的粘膜损伤,促进肠上皮细胞增殖、移行,从而启动受损肠粘膜修复,促进粘膜屏障重建[3]。发现ITF已十余年,人们对ITF进行了多方面的深入研究,包括组织分布、基因定位、重组表达、理化性质、抗体制备、氨基酸序列分析、空间结构确证以及大量的功能学研究等[10]。但对ITF表达调控机制的研究还不够深入,特别是在生理状况下如何维持ITF的高表达还不甚清楚。Seib.T首先扩增了人肠三叶因子(human trefoil factor,hITF)的启动子区序列[6],预测期间存在多个AP-1和Sp1调控元件。随后又发现了多个元件如缺氧诱导因子反应元件(hypoxia inducible factorl resposnse element,HRE)、丁酸反应元件(butyrateresponse element,BRE)等,这些元件在外界因素刺激下能调控hITF的转录和表达[7]。Iwakiri等报道了在鼠类ITF启动子区有杯状细胞反应元件(goblet cell responseelement,GCRE)及杯状细胞沉默子抑制子(goblet cell silencer inhibitor,GCSI)[8][9],他们能单独或与其他正性反应元件协同,促进ITF转录,确保ITF的特异性高表达。hITF启动子中是否也有类似元件还不甚清楚,有学者曾预测在hITF启动子上游存在同源元件,但未进行验证,关于这个问题目前尚无定论。
　　 研究目的:通过对hITF启动子的克隆和转录活性分析,探索hITF特异性高表达的转录调控机制。
　　 研究方法:
　　 1.基因组DNA提取
　　 按试剂盒E.Z.N.A.(R)Tissue DNA kit说明书操作,从3×106个LS-174T细胞中提取人基因组DNA,去离子水溶解,经0.6％琼脂糖凝胶电泳后鉴定片段大小、完整性及纯度。
　　 2.构建hITF启动子荧光素酶报告载体
　　 ①引物设计
　　 从EMBL数据库中查找含hITF的基因序列AB038162,以此为模板用primer3网上引物设计平台(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)设计引物,Tm值设定为60～68℃,上游引物添加MluⅠ酶切位点及3个保护碱基,下游引物添加XhoⅠ或HindⅢ酶切位点及2～3个保护碱基。
　　 ②PCR扩增hITF启动子片段
　　 以人基因组DNA为模板,KOD-Plus高保真酶扩增启动子片段,Ta值设定为60～68℃,30～35个循环。
　　 ⑧克隆至pGL-3 basic荧光素酶报告载体
　　 PCR产物纯化回收后用MluⅠ与XhoⅠ(HindⅢ)双酶切,同时双酶切pGL-3basic质粒,胶回收后用T4 DNA连接酶以3～2:1比例连接克隆片段和质粒,转化DH5α感受态挑取阳性克隆,双酶切鉴定正确后测序。
　　 3.转染HEK-293细胞或LS-174T细胞检测荧光素酶报告活性
　　 ①细胞扩增及种植
　　 HEK-293及LS-174T细胞用含10％牛血清DMEM培养基放37℃5％CO2孵箱中培养,长至80～90％密度后用含10％牛血清DMEM培养基接种于24孔板中,密度约70～80％,过夜培养待细胞贴壁牢固后进行转染。
　　 ②转染
　　 转染前换用不含牛血清的DMEM培养基,每孔0.5ml,各质粒按照等摩尔比进行转染,转染试剂jetPEI与质粒按2μl:1μg比例进行换算,转染后6小时换液,转染后48小时裂解细胞并检测荧光素酶活性。
　　 ③统计分析
　　 采用SPSS13.0统计软件行单因素方差分析,P＜0.05视为差异显著。
　　 研究结果:
　　 1.通过PCR扩增hITF基因-2331/+79区域,并成功构建了pGL-3 hITFpro-2500(-2331/+79)荧光素酶报告质粒,该质粒在LS-174T及HEK-293细胞中活性较低。
　　 2.对-2331/+79片段活性较低进行分析后,预测在外显子1中的+53/+79区域有抑制性元件存在,构建的Vx2.5(-2331/+53)质粒活性明显增加,提示+53/+79区域具有抑制作用。对+53/+179区域以6bp为单位进行替换突变,mut1、mut2、mut3、mut4突变体活性均大幅上升,表明整个+53/+79区域都具有强抑制作用。结合文献分析此区域可能是抑制转录起始位点在2号外显子中的hITF异构体的转录,从而维持具有生物活性的野生型ITF的表达。
　　 3.根据第二部分结果发现在剔除了+53/+79区域后,Vx2.5活性上升,随后构建的-2.0,-1.5,-1.0,-0.5kb都以+53为3'端截止位点,各片段活性较高且接近一致。进一步截短发现-300bp与-200bp之间差异活性显著,细化分区表明-280bp与-260bp片段活性差异明显。结合alibaba2软件预测明确了正性元件的初步位置位于-280/-251区域,针对此区域的-278/-270及-266/-256两个Sp1结合位点分别进行替换突变,mutMIX1和mut Sp1②突变载体活性大幅下降,为突变前的20～25％。最终明确在-278/-270及-266/-256的两个Sp1位点对hITF转录起核心调控作用。
　　 研究结论
　　 1.+53/+79区域是hITF转录调控的主要负性调控区域,其作用可能为抑制hITF异构体的转录,从而维持具有活性功能的野生型hITF的正常表达。
　　 2.位于-278/-270及-266/-256的两个Sp1结合位点对hITF的转录具有正性调控作用,正常生理情况下hITF的高转录活性可能主要依赖Sp1的刺激。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词索引

前言

第一部分 人肠三叶因子启动子区-2331/+79荧光素酶报告载体的构建、鉴定及活性分析

实验一 人肠三叶因子启动子区-2331/+79荧光素酶报告载体的构建

材料和方法

结果

实验二 转染细胞鉴定启动子片段活性

材料和方法

结果

讨论

结论

第二部分 确定人肠三叶因子转录负性调控区域为+53/+79

实验一 初步确定抑制性元件位于+53/+79区域

材料和方法

结果

实验二 最终确定抑制区域位于+53/+79

材料和方法

结果

讨论

结论

第三部分 确定-278/-270及-266/-256两个Sp1位点对hITF转录起关键作用

实验一 初步确定-280/-251区域存在正性调控元件

材料和方法

结果

实验二 确定-78/-270及-266/-256两个Sp1位点对hITF转录起关键作用

材料和方法

结果

讨论

结论

全文总结

致谢

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参考文献

文献综述 肠三叶因子转录调控研究进展