高侵袭性肿瘤细胞的干性特征及临床意义研究

摘要

近年来，研究者发现，在肿瘤细胞群体中存在着一部分特殊的肿瘤细胞亚群，我们谓之肿瘤干细胞（cancer stem cells, CSCs）或者肿瘤起始细胞（tumor initiating cells,TICs）[1-13]。这群细胞具有自我更新、多向分化、无限增殖、重建肿瘤等恶性生物学潜能。它们被认为是肿瘤发生、衍进、侵袭转移、放化疗抵抗以及复发的根源[7-8]。迄今为止，已经在乳腺癌、肺癌、结肠癌、恶性黑色素瘤、胶质瘤等10余种常见肿瘤中分离得到了肿瘤干细胞[14]。肿瘤的侵袭转移是肿瘤的重要恶性生物学表型，近年来，有研究提示肿瘤干细胞在肿瘤的侵袭转移中发挥关键作用。
　　 脑肿瘤的年发病率为14/1000000，占人体所有肿瘤的2％，其中，恶性胶质瘤作为最常见的类型，约占整个脑组织肿瘤的86％ [1]，具有侵袭性生长、血管丰富、易复发以及预后差等特点。这些向外周正常脑组织侵袭生长的胶质瘤细胞，可能是胶质瘤术后复发的主要原因[2-3]。我们前期研究中发现，在人恶性胶质瘤与周围正常脑组织交界处，有大量幼稚的胶质瘤细胞存在。那么这些侵入周围脑组织的胶质瘤细胞是否就是胶质瘤干细胞？即高侵袭性胶质瘤细胞的干性特征如何？尚不清楚。
　　 本部分拟采用Transwell 侵袭小室，在获得高、低侵袭能力的胶质瘤细胞亚群的基础之上，进一步检测肿瘤干细胞标志物的表达情况，并评估其自我更新、成瘤性等干性相关生物学特性。这将有助于加深我们对胶质瘤侵袭性生长行为的认识，从而为提高恶性胶质瘤综合治疗的效果，提供新的实验依据。
　　 结直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一。目前对结直肠癌的恶性程度、侵袭转移以及预后判断等仍然缺乏可靠、敏感地判断指标。乙醛脱氢酶（AldehydeDehydrogenase，ALDH）是一组具有酯酶活性的酶类。它们在辅酶NAD的协同作用下，可以将不同脂肪族和芳香族的醛类物质氧化为酸类物质，保护细胞免受损害。近年来，ALDH1作为ALDH家族的重要亚型之一，其与肿瘤的关系受到越来越多研究者的关注。研究发现， ALDH1的表达与乳腺癌患者的新辅助化疗抵抗、预后等相关。
　　 同时，在子宫内膜癌的研究中发现，ALDH1的表达与淋巴结转移、复发、预后等密切相关。新近，甚至有研究提示，ALDH1可以作为乳腺癌和结直肠癌干细胞的标志物。还有研究发现，ALDH1主要表达于结肠粘膜陷窝干细胞富集的区域以及肿瘤侵袭前沿。结直肠癌肿瘤干细胞候选标记物ALDH1是否与肿瘤的侵袭转移相关，目前尚不清楚。本研究旨在观察ALDH1在结直肠癌及正常结直肠组织中的表达情况，评估该酶的表达同结直肠癌患者组织病理特征之间的关系，以期对临床结直肠癌患者的诊断和预后判断提供依据。
　　 目的
　　 1.获得高、低侵袭力的胶质瘤细胞亚群。
　　 2.观察高侵袭力胶质瘤细胞亚群的干性。
　　 3.探讨结直肠癌干细胞候选标记物ALDH1与结直肠癌侵袭转移等临床病理特征之间的关系。
　　 方法
　　 1.采用铺Matrigel的Transwell小室，从胶质瘤U87细胞系和原代胶质瘤标本中分离高/低侵袭力胶质瘤细胞亚群。
　　 2.以免疫荧光标记激光共聚焦检测方法检测侵袭相关分子的表达情况，包括基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases, MMP）-2、CXC 趋化因子受体4（CXC chemokinereceptor4, CXCR4）。
　　 3.以免疫荧光标记激光共聚焦显微镜、ReAltime RT-PCR、Western-blotting 检测干细胞相关分子Sox2、OCT4（octamer-binding transcription factor-4）、Nanog、CD133、nestin、Bmi1（polycomb group ring finger 4）、MELK（maternAlembryonic leucine zipperkinase）、KLF4（kruppel-like factor-4）的表达。
　　 4.干性相关功能的比较：低密度接种于24孔板，含血清培养基培养，比较克隆形成能力；单细胞接种于96孔板，无血清干细胞培养基培养，比较成球能力；皮下接种于严重联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency, SCID)小鼠，比较成瘤能力。
　　 5. 以免疫组织化学染色、ReAltime RT-PCR、Western-blotting 方法检测ALDH1在结直肠癌和正常结直肠组织中的表达情况，评估该酶的表达和结直肠癌的侵袭转移等临床病理特征间的相关性。
　　 结果
　　 1.侵袭相关分子在高侵袭能力胶质瘤细胞亚群高表达免疫荧光标记激光共聚焦显微镜检测结果显示，侵袭相关分子MMP2、CXCR4在高侵袭力胶质细胞亚群（来源于U87细胞系、原代胶质瘤标本）的表达强度和阳性率均显著高于低侵袭力亚群。
　　 2.高侵袭力胶质瘤细胞亚群高表达干性相关分子（1）免疫荧光标记激光共聚焦显微镜检测结果显示，干细胞相关标记物Sox2、OCT4、Nanog、CD133、CD44、nestin在高侵袭力胶质瘤细胞亚群的表达强度及表达阳性率（97.43％、78.19％、82.22％）显著高于低侵袭力亚群（4.19％、3.38％、38.95％）。
　　 （2）ReAltime RT-PCR 检测结果显示，高侵袭力胶质瘤细胞亚群（来源于U87细胞系）Sox2、OCT4、Bmi1、MELK、KLF4基因mRNA的表达量是低侵袭亚群的3倍、1.45倍、1.5倍、2.25倍、1.5倍。
　　 （3）流式细胞术结果显示，高侵袭力胶质瘤细胞亚群（来源于U87细胞系）Sox2、nestin、OCT4的阳性表达率分别为91.0％、99.5％、85％，而低侵袭力亚群依次为17.7％、68.89％、13％。
　　 （4）Western-blotting 实验结果表明，干性相关分子Sox2、OCT4、nestin 以及侵袭相关分子MMP2、CXCR4在高侵袭力胶质瘤细胞亚群中的表达强度及阳性率，均显著高于低侵袭力亚群。在对原代胶质瘤标本的研究过程中，我们发现Sox2、nestin 以及MMP2在高侵袭力胶质瘤细胞亚群表达分别是低侵袭力亚群的2.8倍、 1.3倍以及2倍。
　　 3.高侵袭力胶质瘤亚群细胞表现出更强的干性（1）高侵袭力胶质瘤亚群克隆形成能力更强体外克隆形成实验结果显示，高侵力胶质瘤细胞亚群（来源于U87细胞系和原代胶质瘤标本1）的克隆形成能力均显著强于相对应的低侵袭力亚群。
　　 （2）高侵袭力胶质瘤亚群成球能力更强单细胞无血清成球实验结果显示，高侵袭力胶质瘤细胞亚群（来源于U87细胞系）
　　 的成球率为12.5％（7/56），而相对应低侵袭力亚群组仅为1.7％(1/60)。
　　 （3）高侵袭力胶质瘤亚群成瘤能力强SCID小鼠皮下接种1×105的高侵袭力胶质瘤细胞，成瘤率可以达到58.3％（7/12），而接种相同数量的低侵袭力胶质瘤细胞，成瘤率仅为8.3％（1/12）。接种1×104细胞，高、低侵袭力组小鼠均未见肿瘤生长。高侵袭力胶质瘤细胞形成的移植瘤，表现出边界不清、向周围软组织侵袭生长、坏死区明显等胶质母细胞瘤的组织病理学特征，而肿瘤向周围组织侵袭性生长的前沿区域，可见神经干/祖细胞标记物nestin的高表达，而移植瘤体中央区表达明显偏低。
　　 4.免疫组织化学染色结果显示，70例结直肠癌及正常结直肠组织中ALDH1的阳性表达率分别为37％和84％，差异明显（P<0.01）；ReAltime RT-PCR 结果显示，ALDH1mRNA在正常结直肠组织的表达量为结直肠癌组织的1.4～17倍；Western-blotting 结果显示，ALDH1在正常结直肠组织中的表达量为结直肠癌组织的1.02～3.99倍。
　　 结论
　　 1.人脑恶性胶质瘤中存在不同侵袭能力的细胞亚群。
　　 2.高侵袭能力胶质瘤细胞亚群具备更强的干性，包括高表达干性标志物Sox2、OCT4、CD133、nestin；高克隆形成能力、高成球能力以及高成瘤能力。
　　 3.结直肠癌干细胞候选标记物ALDH1与结直肠癌肿瘤的侵袭转移等临床病理特征无显著相关性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写词一览表

声明

前 言

第一部分 人脑恶性胶质瘤高、低侵袭能力肿瘤细胞的获得及其干性生物学特性研究

第二部分 结直肠癌干细胞候选标记物乙醛脱氢酶1 在结直肠癌中的表达及临床病理学意义研究

全文讨论

全文总结

参考文献

致 谢

文献综述

硕士期间论文发表情况