基于LC-MS/MS绝对定量人肝细胞中药物转运体及其应用

摘要

目的：
　　本研究旨在探讨药物转运蛋白绝对表达量与其生物功能相关性，可为新药研发和临床安全用药研究提供新的方法。
　　研究方法：
　　选取药物转运体OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1和NTCP作为研究对象。首先优化药物转运体膜蛋白的样品前处理过程，其中包括膜蛋白的提取、增溶剂的选择和胰蛋白酶与蛋白的比率；然后人工合成能代表人肝细胞中OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1和NTCP蛋白的特异性肽段标准品，将相应的稳定性同位素标记的肽段作为内标，优化色谱条件和质谱条件，采用多监测反应模式，建立同时测定OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1和NTCP的分析方法，并进行方法学验证，运用该方法测定23个冻存的人肝细胞药物转运体的表达水平。
　　通过三明治培养的人肝细胞对底物氘代牛磺胆酸钠和瑞舒伐他汀的摄取实验，测出不同批次的肝细胞对这两个底物整体的转运活性。再通过稳定转染人 OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1和NTCP基因的HEK293细胞对底物氘代牛磺胆酸钠和瑞舒伐他汀的摄取实验，测定出相应的Km和Vmax值。最后将测定得到的转运体表达水平与转运体活性相结合，预测转运体介导的对氘代牛磺胆酸钠和瑞舒伐他汀的摄取清除，并研究转运体表达和活性相关性。
　　通过丹红注射液对细胞摄取瑞舒伐他汀的抑制实验，研究丹红注射液对药物转运体OATPs和NTCP的作用，并分析丹红注射液与瑞舒伐他汀联合使用时是否会产生药物间相互作用。
　　研究结果：
　　使用膜蛋白提取试剂盒提取膜蛋白时重复性好；月桂酸钠作为转运体膜蛋白的增溶剂，其增溶效果比脱氧胆酸钠增溶效率更高，并且对特异性肽段的离子化无抑制作用；转运体蛋白酶水解时胰蛋白酶与蛋白的最佳比例为1：5。建立同时测定人肝细胞中四种药物转运体OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1和NTCP的LC-MS/MS分析方法，其定量下限、精密度和准确度均符合大分子的生物分析方法规定。OATP1B1、OATP1B3和OATP2B1均在0.2-50nM范围内线性良好，（r＞0.995）。测定出23个批次中国人肝细胞中的OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1和NTCP蛋白表达平均值分别为4.74、1.39、3.02和3.69 fmol/μg，并发现不同个体之间蛋白表达有很大的差异。
　　在底物摄取实验中，结合转运体蛋白定量，发现这四种转运体在对氘代牛黄胆酸钠和瑞舒伐他汀的肝细胞转运过程中，NTCP分别占整个摄取的89％和68%。又通过人肝细胞模型测定了这两个底物体外整体摄取活性，并比较了这两个底物肝细胞主动摄取清除率预测值跟测定值间的差异，结果显示线性回归相关系数为0.74和0.66；在spearman相关性分析中，spearman秩相关系数rs分别为0.1319和0.3604，均呈正相关。
　　丹红注射液对瑞舒伐他汀在OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1和NTCP细胞中摄取都有一定的抑制作用，IC50分别为0.38mL/100mL,0.14 mL/100mL,0.72 mL/100mL和>3.2 mL/100mL，其中对OATP1B3的抑制效果最强，对NTCP的抑制效果最弱。同时用人肝细胞模型考察了丹红注射液对瑞舒伐他汀整体肝摄取的抑制效果，测得IC50=0.85mL/100mL，提示丹红注射液与瑞舒伐他汀联合使用时有药物相互作用的风险。

目录

声明

中文摘要

英文摘要

目录

英文缩写

第一章 绪论

1.1 引言

1.2 药物转运体的简介

1.3药物转运体的定量方法

1.4药物转运体的体外研究方法

1.5药物转运体的研究意义

第二章 人肝细胞中药物转运体的定量方法研究

2.1 实验目的

2.2 材料与方法

2.3 结果与讨论

第三章 人肝细胞转运底物活性测定以及与转运体含量相关性分析

3.1 实验目的

3.2 材料与方法

3.3结果与讨论

第四章 丹红注射液对肝细胞摄取转运体的抑制

4.1实验目的

4.2材料与方法

4.3实验结果与讨论

第五章 总结

参考文献

攻读硕士学位期间发表论文

致谢