骨髓间充质干细胞对1型糖尿病肾病大鼠足细胞病的治疗及机制研究

摘要

背景和目的：
　　 近年有学者提出了一个新概念-足细胞病(podocytopathy)，即以足细胞数量和(或)密度减少、基底膜增厚、肾小球基质成分改变以及足突融合为特征的肾小球疾病。糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的主要并发症，也是导致终末期肾病的主要原因。近年来，随着对肾小球滤过屏障结构和功能改变的研究，发现足细胞病在DN发生发展中起着关键的作用。DN病理早期表现为足细胞数量减少和裂孔隔膜相关蛋白表达下调，由此引发基底膜增厚，滤过膜功能障碍，最终造成大量蛋白尿和肾功能衰竭。因此，揭示足细胞损伤再生机理，促进足细胞有益的再生是糖尿病肾病足细胞损伤治疗中的一个关键问题。
　　 骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是有多向分化潜能的成体干细胞，具有易获得、易培养、低免疫原性、能在宿主体内长期存活、易于外源基因转染和长期表达等特点。研究已发现MSC对DN有良好的治疗作用。但有关MSC治疗DN的机制仍未明确。
　　 本课题通过建立1型DN大鼠模型，研究MSC对DN足细胞病的治疗作用和对足细胞损伤的修复作用，探讨其可能的保护机制。
　　 方法：
　　 本课题分2部分进行探讨。
　　 第一部分：分离、培养、鉴定大鼠骨髓间充质干细胞，酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)测定细胞上清液中(Vascular endothelialgrowth factor，VEGF)和(Bone morphogenetic protein-7，BMP-7)的含量，以了解MSC是否分泌VEGF和BMP-7；携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluoresceneceprotein，EGFP)基因的慢病毒转导、标记MSC。
　　 第二部分：探讨MSC对DN大鼠的保护作用。实验分为4组：正常对照组(Normalcontrol group，NC)、DN模型组(Diabetic nephropathy group，DN)、DN+medium组(DN+medium)、DN+干细胞治疗组(DN+MSC)。在DN模型成立后(STZ诱导后第30天)，1ml MSC(2×106 cell/ml)和等量培养液分别同时注射入治疗组和DN+medium组大鼠左肾动脉。分别于MSC注射后24小时、60天观察MSC在肾脏定植情况。于治疗60天后，处死四组大鼠。观察各组大鼠血糖(Blood glucose，Glu)，肾重(Kidney weight，KW)，体重(Body weight，BW)、肾质量/体质量计算肾脏肥大指数(KI)、肾功能包括24小时尿蛋白排泄率(Urine albuminuria excretion rate，UAER)和血肌酐(Serum creatinine，Scr)等代谢和生化指标的变化。处死大鼠后，留取肾脏标本进行以下指标的观察。PAS染色行肾组织病理学检查，普通光学显微镜观察肾小球系膜基质增生变化，并计算肾小球硬化指数(Glumerulosclerosis index，GSI)判断肾小球硬化程度；透射电子显微镜观察肾脏超微结构的变化，包括肾小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)厚度、足细胞(podocyte)形态和数量的变化，并计算足突宽度(podocyte foot processes width，FPW)以了解足细胞消失、融合情况；Western blot法和免疫荧光染色法检测肾脏足细胞特异性蛋白nephrin和podocin的表达和定位，以了解足细胞数目和标记蛋白的变化；用ELISA法检测分别检测各组大鼠肾皮质VEGF和BMP-7(促足细胞生存因子)的含量，以了解MSC在受损肾脏旁分泌机制。
　　 结果：
　　 第一部分：
　　 1、通过全骨髓培养法，成功分离、培养了大鼠MSC，第3-5代细胞活性良好，呈贴壁生长，细胞形态以梭形为主，适于后续试验。表面抗原鉴定及成骨、成脂肪诱导结果显示所培养细胞为MSC。
　　 2、相较于普通完全培养基，MSC细胞上清液VEGF和BMP-7含量显著增高(P<0.05)，提示MSC体外培养可分泌VEGF和BMP-7。
　　 3、携带有EGFP的慢病毒转导MSC，在感染复数(Multiplicity of infection，MOI)为20时，转导效率最高，EGFP阳性细胞比率达约80%。转导后细胞未见明显毒性表现或生长不良现象。
　　 第二部分：
　　 1、STZ单次大剂量注射后，连续3天监测随机血糖，血糖≥16.7mmol/L判定1型糖尿病模型建立成功；成模后30天，尿常规检测出尿微量白蛋白定性阳性，判定DN形成。
　　 2、在注射MSC24小时及60天后，激光共聚焦显微镜检测到MSC在大鼠左侧肾脏肾小球定植。注射后24h和60天，分别有约20%和3%肾小球可见明显1-2个绿色荧光阳性区域，随着时间延长，绿色荧光强度逐渐减弱。
　　 3、与NC大鼠比较，三组DN大鼠Glu、KW、KI、Scr、24h UAER均显著增高(P<0.05)，BW显著降低；相较于DN组和DN+medium组大鼠，MSC治疗组大鼠KW、KI、Scr、24h UAER均显著下降(P<0.05)，但Glu、BW无明显变化(P>0.05)。
　　 4、与NC大鼠比较，三组DN大鼠肾组织VEGF表达显著增加，BMP-7表达显著降低；相较于DN组和DN+medium组，MSC治疗组大鼠肾组织中BMP-7表达显著增加(P<0.05)，VEGF表达无明显差异(P>0.05)。
　　 5、光镜观察MSC治疗组大鼠肾脏病理较其他两组DN大鼠肾小球体积减小，系膜扩张减轻、系膜基质增生减少；电镜观察MSC治疗组大鼠较其他两组DN大鼠肾脏基底膜厚度减少，足细胞数量增多，足突增宽、扁平及足突融合、消失情况明显改善，FPW数值较对照组明显减小(P<0.05)提示足细胞数量增加。
　　 6、Western blot和免疫荧光染色结果均显示，MSC治疗使大鼠肾小球足细胞特异性蛋白nephrin和podocin表达上调，提示足细胞标记蛋白增加。
　　 结论：
　　 MSC治疗可改善DN受损肾脏功能，有效降低24h UAER、抑制DN大鼠的肾脏肥大，缓解肾小球硬化，特别是修复足细胞损伤(增加足细胞数量、改善足细胞形态)，对足细胞病有改善作用。这些结果提示MSC对DN的治疗作用与其足细胞保护有关，其机制可能与其分泌BMP-7有关。研究结果为未来BMP-7治疗DN提供了新的实验基础。

目录

文摘

英文文摘

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前 言

第一部分 大鼠骨髓间充质干细胞原代培养、鉴定、标记及细胞上清液测定

材料和方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分 骨髓间充质干细胞对1型糖尿病肾病大鼠足细胞病的治疗及机制研究

材料和方法

结 果

讨 论

小 结

全文结论

致谢

照 片

参考文献

文献综述 足细胞损伤与糖尿病肾病的研究进展

参考文献

硕士在读期间发表的文章