核激素受体在皮肤主要构成细胞和表皮鳞癌A431细胞中的表达及其部分配体的调节效应

摘要

研究背景与目的:
　　核激素受体(nuclearhormonereceptor,NHR)超家族是目前已知的最大的一类真核转录因子家族。近十年来,该家族的成员以惊人的速度从各类动物中鉴定和发现,使得核受体超家族的结构和功能成为分子生物学研究的热点之一。核受体超家族由共同的祖先进化演变而来,具有共同的结构特征。通过与特定的应答元件的识别和结合,对靶基因的转录进行调控,在生物体的发育、分化以及体内平衡稳定等多种生理活动中发挥重要作用。配体激活的核激素受体在核内与DNA结合,调节相应基因的表达。它们在保持多种细胞和组织,包括皮肤的稳定方面发挥关键作用。
　　核激素受体超家族的成员数量之多远远超出了人们当初的预料。到目前为止,已经超过了150个,使得这一超家族成为目前已知的最大的一类真核转录因子家族。不仅包括已发现配基的盐皮质激素受体(Mineralocorticoidreceptor,MR)、糖皮质激素受体(GlucocorticoidReceptor,GR)、孕酮受体(Progesteronereceptor,PR)、雄激素受体(Androgenreceptor,AR)、雌激素受体(EstrogenReceptor,ER)、甲状腺素受体(Thyroidhormonereceptor,TR)、维生素D3受体(VitaminD3receptor,VDR)和维甲酸受体(RAR和RXR),还包括大量的配基未知的孤儿受体(orphanreceptors)。
　　核激素受体在调节皮肤发育过程中发挥重要作用,它们还参与调节细胞代谢,增殖、分化、细胞凋亡和炎症过程等。关于糖皮质激素、雄激素以及雌激素受体对皮肤的作用已进行广泛研究。随着研究深入,发现核激素受体的其他很多成员在维持皮肤平衡方面也发挥了重要作用。其中一组与RXR形成异源二聚体的亚群受体中,多种受体(比如RAR和VDR)的配体已成功用于皮肤病的治疗。不同的受体在皮肤中发挥不同作用,而且可以随机的选取靶向药物用于皮肤病的临床治疗。目前研究致力与确定更多的核激素受体亚群成员对皮肤的作用,其中包括过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisomeproliferators-activatedreceptors,PPARs)、和肝X受体(LiverXreceptors,LXRs)。
　　通常情况下,膜受体与配体结合(如生长因子),启动胞浆内的级联反应。与膜受体不同的是,配体与其核受体结合后,可以将信号传递至核内的转录机器,但是其作用不仅仅局限在核内,它们也可以直接与胞浆内的信号通路直接作用。最为特殊的一点是,膜受体只一小部分的受体激活通过下游的级联反应就能产生最大的反应强度,而核激素受体的受体占用率则通常与激素的反应强度呈平行关系,即核激素受体的表达水平高低决定了相应激素的作用效果,水平越高,则反应强度越强,反之亦然。
　　人类皮肤中存在哪些核激素受体家族成员表达,且其表达水平如何?其相应配体对正常皮肤功能会有何调节作用?核激素受体家族成员在正常皮肤表皮细胞与鳞状细胞癌的表达之间是否存在差异?这种表达异常是否在皮肤恶性肿瘤的发生及发展过程中发挥重要作用?高表达受体成员是够能成为肿瘤治疗的特异性靶点?针对上述问题,本实验采用PCRarray方法检测皮肤的主要组成细胞(表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞)以及皮肤鳞状细胞癌细胞A431细胞系中核激素受体的表达水平以了解核激素受体各相关成员mRNA表达情况,并选取相应的受体配体对A431肿瘤细胞进行药物处理,观察相应配体对细胞增殖、分化以及细胞周期等细胞生理特性的影响。本研究旨在深入了解核激素受体在调控皮肤细胞功能以及肿瘤细胞失控性过度增殖机制中的作用,并有助于寻找特异性靶点而为皮肤相关疾病提供潜在的治疗药物。
　　研究方法与结果:
　　1.应用PCRarray方法分别检测了核激素受体家族成员在皮肤主要构成细胞-表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞mRNA的表达水平,发现在皮肤主要构成细胞中主要表达的核激素受体以RXR异构二聚体家族成员为主,表皮角质形成细胞内核激素受体表达水平普遍高于真皮成纤维细胞。
　　2.外用甲状腺素类似物-TRIAC处理C57BL/6小鼠一周后,免疫组织化学方法结果提示TRIAC可明显促进小鼠表皮细胞增殖,导致表皮厚度增加,但显著降低皮肤表皮中细胞分化标记物的表达水平。
　　3.MTS结果提示TRIAC可促进体外培养人正常角质形成细胞增殖,Real-timePCR及WesternBlotting结果提示TRIAC可显著促进角质形成细胞内增殖标记物PCNA的表达水平升高,抑制细胞分化标记物的表达;流式细胞术结果提示TRIAC可明显促进体外培养角质形成细胞中G1期细胞比例降低,而S期细胞比例升高。
　　4.应用PCRarray方法检测皮肤鳞癌A431细胞中核激素受体的表达情况,提示皮肤鳞状细胞癌细胞中也存在大量核激素受体表达,与正常角质形成细胞相比,鳞状细胞癌细胞中,部分RXR异构二聚体家族成员mRNA表达水平明显升高。
　　5.MTS结果发现多种新合成的RXR二聚体家族配基中,LXR受体激动剂(T0901317和GW3965)可明显抑制体外培养的皮肤鳞癌A431细胞增殖。
　　6.流式细胞术结果提示LXR受体激动剂可导致A431细胞周期中G0/G1期细胞比例明显升高,S期细胞比例显著降低。
　　7.PCR结果和WesternBlotting结果提示LXR受体激动剂处理后,导致A431细胞中细胞增殖标记物PCNA的表达水平明显降低。转录调节因子KLF4表达水平明显升高,其下游基细胞周期抑制因子p21表达水平明显升高。
　　8.应用RNAi技术沉默A431细胞中LXRβ受体后,再次LXR受体激动剂处理干扰后细胞,PCR结果提示LXR受体激动剂对相关基因的诱导作用明显减弱。
　　结论:
　　正常皮肤角质形成细胞和成纤维细胞中都存在大量核激素受体家族成员的表达,其中以RXR异构二聚体亚家族成员为主。表皮是核激素受体表达的主要部位,提示表皮细胞可能是核激素受体作用的重要靶细胞。作为RXR异构二聚体亚家族的重要一员,甲状腺素类似物可明显促进表皮细胞增殖,显著抑制表皮细胞分化。
　　皮肤鳞状细胞癌细胞中也存在上述核激素受体的表达。与正常表皮细胞相比,鳞状细胞癌细胞中部分RXR异构二聚体亚家族成员表达明显升高。LXR受体激动剂可通过LXR-β依赖途径调节转录因子KLF4和细胞周期因子p21的表达,导致A431细胞出现周期停滞,抑制细胞增殖。LXR信号途径可能成为皮肤鳞状细胞癌治疗中的重要靶点。

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缩略语表

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第一章 前言

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 甲状腺素类似物-TRIAC对皮肤表皮细胞功能调节及机制研究

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 核激素受体在皮肤鳞癌A431细胞中的表达

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 结果

4.4 讨论

4.5 小结

第五章 LXR激动剂对皮肤鳞状细胞癌细胞增殖抑制作用及其机制研究

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.3 结果

5.4 讨论

5.5 小结

全文总结

参考文献

文献综述甲状腺相关激素与皮肤

参考文献

攻读博士学位期间发表论文

致谢