维生素D在结核杆菌感染条件下对小鼠获得性免疫表型和功能的影响及机制研究

摘要

背景：
　　脊柱结核是最常见的肺外结核,常导致椎体破坏和严重的并发症,时刻威胁人类的健康安全。2010年,世界卫生组织报道每年大约有146万人死于结核。目前脊柱结核患者多数出现耐药,甚至耐多种药,使脊柱结核的化疗面临严峻的挑战。脊柱结核的化疗源于结核病,深入研究结核病的发病机制,有利于脊柱结核的治疗。
　　维生素D在20世纪40年代末期曾用来治疗结核,20世纪50年代中期,随着抗结核药物的出现,维生素D用来治疗结核的热情已明显下降。然而,现在越来越多的结核患者感染多耐药菌株,出现结核耐药,常规的抗结核治疗无效。因此,我们反思,维生素D可能在耐药结核中起着重要的作用,但是有关维生素D在结核病治疗的疗效方面还存在分歧。Morcos等报道在结核的标准化疗过程中加入维生素D,明显提高患者的临床疗效,影像学也有所改变。Nursyam等也报道结核患者治疗中补充维生素D,影像学表现有明显改善。最近,Martineau等发现口服四倍剂量的维生素D3明显提高TaqIVDR(tt基因型)结核患者痰培养转换时间。相反,Wejse等认为维生素D治疗未能提高结核患者的临床治疗效果,而且,Sato等阐述低水平的维生素D是活动性肺结核患者愈后良好的一个观察指标。Koo等研究发现,在韩国人口中,维生素D水平与结核病的发展无直接相关性,在经过抗结核治疗后,25(OH)D水平下降。因此,维生素D在结核感染中的作用机理值得进一步深入研究。
　　已有研究报道维生素D在结核感染的先天性与获得性免疫中起着重要作用。最近,维生素D如何影响结核先天性免疫已有众多文献明确阐明。然而,维生素D是如何影响结核获得性免疫的研究还不够深入。结核杆菌感染时,树突状细胞是启动获得性免疫的最基本细胞,树突状细胞在吞噬结核抗原后,其生物学作用发生了改变,细胞表面高表达表面共刺激分子,并逐渐移向淋巴结,这一过程是树突状细胞的成熟过程。而且,研究报道树突状细胞在吞噬Early Secretory Antigenic Target6-kDa(ESAT-6)抗原后,开始启动CD4+T免疫应答。说明树突状细胞在结核感染中启动获得性免疫应答,但维生素D在结核感染中是如何影响树突状细胞?相关研究还不够深入。
　　因此,本课题的主要研究内容是:维生素D在结核杆菌感染条件下对小鼠获得性免疫表型和功能的影响及机制。
　　方法：
　　1、建立维生素D缺乏、维生素D正常和维生素D充足三组小鼠动物模型,ELISA方法检测三组小鼠血清中25(OH)D和1,25(OH)2D3的差异。
　　2、检测结核杆菌感染时三组小鼠脾脏CD4+T和CD8+T百分比、CD4+T/CD8+T细胞比值,同时用ELISA方法检测脾脏细胞悬液经TB-PPD诱导后,IFN-γ和IL-10水平。
　　3、小鼠骨髓细胞诱导成树突状细胞的培养方法及鉴定,流式检测CD11C,MHC-II,CD80,CD86,光镜、扫描电镜及透射电镜观察细胞形态。
　　4、检测不同维生素D水平对树突状细胞表达CD11C、MHC-II、CD80和CD86差异。
　　5、检测不同浓度维生素D树突状细胞对T细胞增殖影响。
　　6、检测不同浓度维生素D对骨髓细胞诱导成树突状细胞的增殖影响。
　　7、检测不同浓度维生素D对树突状细胞分泌干扰素(IFN-γ),IL-2,IL-4,IL-6,IL-10和IL-12的差异。
　　8、检测不同浓度维生素D对树突状细胞表达VDR和CYP27B1的差异。
　　结果：
　　1、25(OH)D和1,25(OH)2D3在-D组、正常组和+D组分别是11.6±3.56nmol/l和20±3.46pmol/l,76.5±9.13nmol/l和120±10.28pmol/l,78.1±9.16nmol/l和130±12.15pmol/l,正常组和+D组无明显统计学差异。然而,25(OH)D和1,25(OH)2D3在-D组明显少于正常组。
　　2、CD4+T在-D组、正常组、+D组百分比分别为27.1±0.6,23.62±0.42,19.46±0.32,三组之间有明显统计学差异。CD8+T细胞的百分比分别是12.15±0.61,8.7±0.64,7.12±0.48,三组之间有明显统计学差异。CD4+T/CD8+T比值在-D组、正常组、+D组分别是2.23±0.15,2.71±0.21,2.73±0.31,三组之间有明显统计学差异。细胞因子IFN-γ在-D组、正常组、+D组水平分别为416.42±16.46、325.41±11.16、276.26±25.32(单位pg/ml),三组之间有显著统计学差异。细胞因子IL-10在-D组、正常组、+D组分别为16.45±1.58、24.31±2.16、26.28±0.42(单位pg/ml),三组之间有统计学差异。
　　3、小鼠骨髓细胞成功诱导成树突状细胞。CD11C的阳性率平均为87.23％,MHC-II的阳性率平均为89.26%,CD86的阳性率平均为58.94%,CD80的阳性率平均为84.69%。光镜、扫描电镜和透射电镜结果示典型枝状突起。
　　4、CD11C在对照组、25(OH)D3(100nM)组、1,25(OH)2D3(10pM)组及1,25(OH)2D3(100nM)组分别是84.64%±4.00,82.28%±7.27(p=0.85),81.17%±6.15(p=0.79)和32.25%±3.02(P<0.001),共刺激分子的表达在对照组、25(OH)D3(100nM)组、1,25(OH)2D3(10pM)组及1,25(OH)2D3(100nM)组分别是:MHC-II:88.75%±4.14,85.92%±4.05(p=0.54),83.37%±3.96(p=0.46)和46.65%±1.24(P<0.001);CD80:84.51%±8.63,84.75%±9.37(p=0.68),83.15%±8.48(p=0.61)and65.67±7.12(P<0.001);CD86:57.08%±9.55,51.32%±9.21(P<0.05),50.15%±8.76(P<0.05)and15.69%±3.12(P<0.001)。
　　5、25(OH)D3(100nM)组和1,25(OH)2D3(10pM)组降低了T淋巴细胞的增殖,1,25(OH)2D3(100nM)组明显降低了T淋巴细胞的增殖。
　　6、OD值在对照组、25(OH)D3(100nM)组、1,25(OH)2D3(10pM)组及1,25(OH)2D3(100nM)组分别是0.61±0.25,0.54±0.25,0.49±0.24和0.21±0.15。对照组明显促进树突状细胞的增殖,维生素D组抑制了树突状细胞的增殖。
　　7、同对照组相比,在25(OH)D3(100nM)组、1,25(OH)2D3(10pM)组,IFN-γ、IL-2、IL-6和IL-10明显升高,IL-4降低。然而,IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10和IL-12在1,25(OH)2D3(100nM)明显降低,IL-4明显升高。
　　8、小鼠骨髓细胞诱导的树突状细胞能表达CYP27B1和VDR,在25(OH)D3(100nM)组,CYP27B1的表达高于对照组,但在1,25(OH)2D3(100nM)和对照组无差别。VDR的表达,在25(OH)D3(100nM)组比对照组低,但在1,25(OH)2D3(100nM)和对照组无差异。
　　结论：
　　1、通过控制食物和光照,成功建立维生素D缺乏小鼠动物模型。维生素D缺乏明显影响小鼠抗结核免疫功能,提示维生素D缺乏与结核易感密切相关。
　　2、结核杆菌感染时,维生素D通过调节树突状细胞VDR和CYP27B1的表达来影响它的成熟和功能,防止过度免疫应答。

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第一章 前言

第二章 维生素D缺乏小鼠模型的建立及维生素D对机体抗结核免疫的影响

2.1 维生素D缺乏小鼠模型的建立及鉴定

2.1.1 材料与方法

2.1.2 结果

2.1.3 讨论

2.2 维生素D缺乏对小鼠抗结核免疫的影响

2.2.1 材料与方法

2.2.2 结果

2.2.3 讨论

第三章 维生素D在结核感染条件下对小鼠树突状细胞的免疫表型和功能的影响及机制研究

3.1 小鼠骨髓来源的树突状细胞的培养及鉴定

3.1.1 小鼠骨髓来源树突状细胞的培养方法一

3.1.2 小鼠骨髓来源树突状细胞的培养方法二

3.2 维生素 D 在结核感染中对小鼠树突状细胞的免疫表型和功能的影响及机制研究

3.2.1 材料与方法

3.2.3 结果

3.2.4 讨论

全文结论

参考文献

文献综述一维生素D与结核

参考文献

文献综述二树突状细胞与结核

参考文献

攻读博士期间发表论文

致谢