结核杆菌Hsp16.3对感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡的影响及其机制研究

摘要

目的:探讨结核杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3在结核杆菌感染中对小鼠肺泡巨噬细胞凋亡的影响及其机制。
　　方法:分别将结核杆菌国际标准强毒株H37Rv株Hsp16.3基因缺失突变菌株(△H37Rv)、结核杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株(H37Rv)、卡介苗株Hsp16.3基因缺失突变菌株(△BCG)、卡介苗菌株(BCG)以及无菌生理盐水(空白对照)通过小鼠尾静脉注入小鼠体内以建立小鼠的感染模型,并在感染后的1d、3d、5d、7d、9d、11d、13d、15d分离及鉴定小鼠肺泡巨噬细胞,用激光共聚焦显微镜技术检测及鉴定结核杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞,流式细胞术检测不同时相感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡率,WesternBlot检测感染小鼠肺泡巨噬细胞内Caspase-3蛋白、Bcl-2蛋白的表达。
　　结果:激光共聚焦显微镜下观察到△H37Rv组、H37Rv组、△BCG组、BCG组小鼠肺泡巨噬细胞内有标记MTB65KD的绿色荧光,而空白对照组未见绿色荧光,证实结核杆菌Hsp16.3基因缺失突变菌株和结核杆菌正常菌株在感染小鼠后均能被小鼠肺泡巨噬细胞大量吞噬。△H37Rv组和H37Rv组凋亡率均高于对照组,△H37Rv感染组的巨噬细胞凋亡率1~7d内逐渐升高,至7d时达到高峰,随后逐渐降低;H37Rv感染组的巨噬细胞凋亡率在1~9d内逐渐升高,至9d时达到高峰,随后逐渐降低;△H37Rv感染组与H37Rv感染组相比,1d至7d内,各时间段△H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率均显著高于H37Rv感染组(P<0.05),随时间延长,巨噬细胞凋亡程度发生了逆转,9d至11d内,△H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率低于H37Rv感染组,而13至15d内,△H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率高于H37Rv感染组,差异均有统计学意义(P<0.05);△BCG组凋亡率1d至7d内呈明显下降趋势,7d后巨噬细胞凋亡率变化趋于平稳与正常对照组差异无统计学意义,而BCG组巨噬细胞凋亡率仅在感染9d时与正常对照组差异有统计学意义;△BCG组的巨噬细胞凋亡率在1d至5d内显著高于BCG组(P<0.05),7d至15d内,△BCG组与BCG组巨噬细胞凋亡率无明显差异;不同时相H37Rv组和BCG组比较以及△H37Rv组与△BCG组比较,巨噬细胞凋亡率差异均有统计学意义。H37Rv组和△H37Rv组的巨噬细胞Caspase-3和Bcl-2蛋白表达水平均高于正常对照组;1d至7d内,H37Rv感染组和△H37Rv感染组的巨噬细胞Caspase-3表达水平逐渐升高,至第7d达到高峰,且△H37Rv感染组在第13d时出现第二次高峰,但Caspase-3表达水平均高于H37Rv感染组,差异有统计学意义;1d至13d内,△BCG组的巨噬细胞Caspase-3表达水平逐渐降低但始终高于BCG组(P<0.05),BCG组不同时相的巨噬细胞Caspase-3表达水平无明显变化,与正常对照组相比差异无统计学意义;不同时相H37Rv组巨噬细胞Caspase-3表达水平均高于BCG组;感染后第1d,△H37Rv组巨噬细胞Caspase-3表达水平低于△BCG组(P<0.05),但第3d后△H37Rv组巨噬细胞Caspase-3表达水平始终高于△BCG组(P<0.05);在感染的早期(1~7d),△H37Rv感染组Bcl-2的表达水平无明显变化,但在9d后逐渐升高;H37Rv感染组巨噬细胞内Bcl-2的表达水平1~7d内无明显变化,7d后逐渐升高,但△H37Rv感染组Bcl-2的表达水平始终低于H37Rv组且7d后表现更为显著;BCG组和△BCG组的巨噬细胞Bcl-2蛋白表达水平均高于正常对照组,△BCG组巨噬细胞内Bcl-2的表达水平1~5d逐渐升高,随后降低,至7d后变化趋于平稳且在3~11d内Bcl-2的表达水平高于△H37Rv组(P<0.05);BCG组Bcl-2表达水平在不同时相无明显差异,但始终高于△BCG组且在1~10d内高于H37Rv组(P<0.05)。
　　结论:1、感染结核杆菌的小鼠其肺泡巨噬细胞的凋亡率与结核杆菌的毒力相关,毒力强的结核杆菌有较强的致感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡的作用;
　　2、结核杆菌国际标准强毒株比卡介苗菌株更能促进感染小鼠肺泡巨噬细胞内的凋亡蛋白酶Caspase-3的表达,而对感染小鼠肺泡巨噬细胞内Bcl-2基因表达的诱导作用比卡介苗弱;
　　3、相同毒力的结核杆菌相比,结核杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3基因缺失突变菌株比正常菌株有更强的致感染小鼠肺泡巨噬细胞凋亡的作用,这种致凋亡作用与结核杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3基因的缺失相关;
　　4、结核杆菌小分子热休克蛋白Hsp16.3在结核杆菌感染的早期和晚期能够抑制小鼠肺泡巨噬细胞的凋亡,而这种抑制作用可能是通过抑制凋亡蛋白酶Caspase-3的表达,同时促进Bcl-2蛋白的表达来实现的。