网格蛋白和微囊在LPS致血管通透性增高中的作用及机制

摘要

血管通透性增高是严重创伤、脓毒症患者的重要病理改变，表现为血管内皮屏障受损，对液体、血浆蛋白、大分子物质的通透性增高，导致组织水肿，促进内环境紊乱等合并症发生，研究阐明血管通透性增高的发生机制有助于维持内环境稳定、改善疗效和提高存活率。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是脓毒症的重要启动因子，目前认为LPS引起血管通透性增高主要有两条途径:“细胞间”途径和“跨细胞”途径。其中，“细胞间”途径开放主要由内皮细胞张力丝形成并收缩引起，并认为是调节血管通透性增高的主要途径。然而近来研究发现，细胞张力丝聚合发生在LPS作用后的早期，4h后细胞骨架解聚重构，张力丝消失，提示LPS诱导血管通透性增高还存在其他调节机制。
　　根据基础研究，黏附连接是血管内皮细胞间（除血脑屏障外）的主要连接方式，其主要结构蛋白血管内皮钙粘蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cad)被胞吞可以引起黏附连接强度降低、细胞间隙开放和血管通透性增高。以往研究表明，VE-cad在细胞质膜的表达取决于被胞吞的多少，而VE-cad的胞吞主要受网格蛋白介导，但近来有研究发现，上皮钙粘蛋白(epithelial cadherin，E-cad)的胞吞可以通过非网格蛋白途径——细胞质膜微囊(caveolae，简称微囊)途径完成，例如在人表皮样癌细胞和胰腺导管癌上皮细胞，微囊可以胞吞E-cad，引起上皮细胞间黏附连接破坏、细胞分离和肿瘤转移。那么，网格蛋白介导和微囊介导的VE-cad胞吞是否参与了LPS诱导的血管通透性增高，机制如何？
　　据此，我们以CRL-2922内皮细胞株为研究对象，研究内容为以下三部分:①观察网格蛋白介导和微囊介导的VE-cad胞吞在LPS诱导血管通透性增高中的作用;②探讨网格蛋白介导和微囊介导的VE-cad胞吞导致LPS作用后不同程度的血管通透性增高的机制;③探讨LPS作用后网格蛋白介导和微囊介导的VE-cad胞吞途径转换的机制。
　　主要实验方法:
　　第一部分网格蛋白介导和微囊介导的VE-cad胞吞在LPS诱导血管通透性增高中的作用
　　（一）网格蛋白介导的VE-cad胞吞在LPS诱导血管通透性增高中的作用
　　1.采用人血管内皮细胞株CRL-2922，检测LPS(10μg/mL)作用不同时间(1h、2h、4h和6h)后VE-cad质膜蛋白表达、单层细胞通透性，观察变化规律。
　　2.采用人血管内皮细胞株CRL-2922，观察LPS作用不同时间(1h、2h、4h和6h)后网格蛋白与VE-cad的免疫共沉淀和共定位。
　　3.采用网格蛋白胞吞抑制剂CPZ(100μmol/L)和网格蛋白重链siRNA(50nmol/L)，观察其对LPS作用(1h和4h)后网格蛋白与VE-cad的免疫共沉淀、VE-cad质膜蛋白表达，以及单层细胞通透性的影响。
　　（二）微囊介导的VE-cad胞吞在LPS诱导血管通透性增高中的作用
　　1.采用人血管内皮细胞株CRL-2922，观察LPS作用不同时间(1h、2h、4h和6h)后Cav1与VE-cad的免疫共沉淀和共定位。
　　2.采用微囊抑制剂filipin(5μg/mL)和Cav1 siRNA(50 nmol/L)，观察其对LPS作用(1h和4h)后Cav1与VE-cad的免疫共沉淀、VE-cad质膜蛋白表达，以及单层细胞通透性的影响。
　　3.采用人血管内皮细胞株CRL-2922，观察LPS作用不同时间(1h、2h、4h和6h)后微囊主要结构蛋白Cav1的蛋白表达和磷酸化(Tyr14)，以及Src的蛋白表达的变化，并观察Src抑制剂SU6656(2μmol/L)和TLR4抑制剂CLI-095(5μg/mL)对LPS作用(1h和4h)后的Cav1磷酸化(Tyr14)、Cav1与VE-cad的免疫共沉淀、P-Cav1与VE-cad的免疫共沉淀、VE-cad质膜蛋白表达，以及单层细胞通透性的影响。
　　第二部分网格蛋白介导和微囊介导的VE-cad胞吞导致LPS作用后不同程度的血管通透性增高的机制
　　1.采用人血管内皮细胞株CRL-2922，观察LPS作用不同时间(1h、2h、4h和6h)后VE-cad与Rab11（循环内颗粒标志物）的免疫共沉淀、VE-cad与LAMP2(次级内颗粒/溶酶体标志物)的免疫共沉淀的变化。
　　2.采用网格蛋白胞吞抑制剂CPZ和微囊抑制剂filipin，观察其对LPS作用(1h和4h)后VE-cad与Rab11的免疫共沉淀、VE-cad与LAMP2的免疫共沉淀的影响。
　　第三部分 LPS作用后网格蛋白介导和微囊介导的VE-cad胞吞途径转换的机制
　　1.采用人血管内皮细胞株CRL-2922，观察LPS作用不同时间(1h、2h、4h和6h)后细胞骨架的动态变化。
　　2.采用细胞骨架解聚剂Cyt D(2μmol/L)和细胞骨架稳定剂Jasp(1μmol/L)，观察其对LPS作用(1h和4h)后网格蛋白与VE-cad的免疫共沉淀、Cav1与VE-cad的免疫共沉淀、VE-cad与Rab11的免疫共沉淀、VE-cad与LAMP2的免疫共沉淀、VE-cad质膜蛋白表达，以及单层细胞通透性的影响。
　　主要结果:
　　一、网格蛋白介导和微囊介导的VE-cad胞吞在LPS诱导血管通透性增高中的作用
　　（一）网格蛋白介导的VE-cad胞吞在LPS诱导血管通透性增高中的作用
　　1.正常对照组中VE-cad在质膜蛋白表达高，LPS(10μg/mL)作用后VE-cad质膜蛋白表达逐渐降低(P＜0.05），VE-cad的总蛋白表达也逐渐降低（P＜0.05）。LPS作用后单层细胞通透性呈时间依赖性的增高（P＜0.05）。
　　2.LPS作用后网格蛋白的表达逐渐降低（P＜0.05）;网格蛋白与VE-cad的免疫共沉淀在LPS作用1h后增高(P＜0.05），然后逐渐降低;免疫组合激光共聚焦显微镜观察到网格蛋白与VE-cad的共定位在LPS作用1h后增高，在LPS作用4h后降低。
　　3.网格蛋白胞吞抑制剂CPZ(100μmol/L)和网格蛋白重链siRNA(50 nmol/L)可以显著降低LPS作用1h后网格蛋白与VE-cad的免疫共沉淀(P＜0.05)，增高LPS作用1h后VE-cad质膜蛋白表达(P＜0.05），改善LPS作用1h后的单层细胞通透性(P＜0.05);但对LPS作用4h后网格蛋白与VE-cad的免疫共沉淀、VE-cad质膜蛋白表达，以及单层细胞通透性没有显著影响。
　　（二）微囊介导的VE-cad胞吞在LPS诱导血管通透性增高中的作用
　　1.LPS作用后，Cav1与VE-cad的免疫共沉淀在正常对照组中几乎未见，随着LPS作用时间延长而逐渐增高（P＜0.05），免疫组化激光共聚焦显微镜观察其共定位也发现在LPS作用4h后有明显的共定位。
　　2.微囊抑制剂非律平(5μg/mL)和Cav1 siRNA(50 nmol/L)可以显著降低LPS作用4h后Cav1与VE-cad的免疫共沉淀，并增高VE-cad质膜蛋白表达，以及改善单层细胞通透性(P＜0.05)。
　　3.LPS作用后，微囊主要的蛋白成分Cav1的蛋白表达无显著变化，但其Tyr14位点磷酸化水平却逐渐增高(P＜0.05），Src蛋白表达呈时间依赖性的增高(P＜0.05），TLR4抑制剂CLI-095(5μg/mL)可显著降低LPS作用4h后增高的Src蛋白表达。Src抑制剂SU6656(2μmol/L)和TLR4抑制剂CLI-095(5μg/mL)可显著降低LPS作用4h后的Cav1磷酸化(Tyr14)，减少Cav1与VE-cad的免疫共沉淀以及P-Cav1与VE-cad的免疫共沉淀（P＜0.05），增加VE-cad质膜蛋白表达(P＜0.05)，以及单层细胞通透性显著降低(P＜0.05）。
　　二、网格蛋白介导和微囊介导的VE-cad胞吞导致LPS作用后不同程度的血管通透性增高的机制
　　1.LPS作用后，VE-cad与Rab11的免疫共沉淀在1h增高(P＜0.05)，随后逐渐降低;VE-cad与LAMP2的免疫共沉淀在正常时几乎未见，但随LPS作用时间延长，呈时间依赖性的增高（P＜0.05）。
　　2.LPS作用1h后增高的VE-cad与Rab11免疫共沉淀可以被网格蛋白胞吞抑制剂CPZ显著抑制(P＜0.05），但不受微囊抑制剂非律平的影响;LPS作用4h后增高的VE-cad与LAMP2的免疫共沉淀可以被微囊抑制剂显著抑制（P＜0.05），但不受网格蛋白胞吞抑制剂的影响。
　　三、LPS作用后网格蛋白介导和微囊介导的VE-cad胞吞途径转换的机制
　　1.正常对照组中，肌动蛋白呈均匀散在分布，细胞骨架无明显的聚合;LPS作用1h后，肌动蛋白聚集呈点片状，发生明显聚合，可见细胞中细长的张力丝形成;4h后肌动蛋白重新显示出散在分布的趋势，细胞骨架解聚，张力丝几近消失。
　　2.细胞骨架解聚剂Cyt D可显著抑制LPS作用1h后增高的网格蛋白与VE-cad以及VE-cad与Rab11免疫共沉淀（P＜0.05），显著增高Cav1与VE-cad以及VE-cad与LAMP2的免疫共沉淀（P＜0.05），显著降低VE-cad质膜蛋白表达(P＜0.05)，并加重LPS作用1h后的单层细胞通透性增高(P＜0.05）。在LPS作用1h后给予细胞骨架稳定剂Jasp处理，可以显著降低LPS作用4h后的Cav1与VE-cad以及VE-cad与LAMP2的免疫共沉淀(P＜0.05），增高LPS作用4h后的VE-cad质膜蛋白表达(P＜0.05)，并改善LPS作用4h后的单层细胞通透性（P＜0.05）。
　　结论:
　　1.网格蛋白介导和微囊介导的VE-cad胞吞均参与了LPS诱导的血管通透性增高，网格蛋白介导的VE-cad胞吞主要发生在LPS作用的早期(1～2h)，而微囊介导的VE-cad胞吞主要发生在LPS作用后期(4h)，并由LPS-TLR4-Src信号途径激活。
　　2.VE-cad经网格蛋白介导的胞吞后位于循环内颗粒中，导致LPS作用早期(1～2h)VE-cad质膜蛋白表达丢失和单层细胞通透性有限的增高，而VE-cad经微囊介导的胞吞后位于次级内颗粒/溶酶体中，导致后期(4h)严重的VE-cad质膜蛋白表达丢失和单层细胞通透性增高。
　　3.LPS作用后细胞骨架先发生聚合然后解聚，这种动态变化调节VE-cad胞吞由网格蛋白介导向微囊介导转换。