VWF加重小鼠TBI后微囊泡介导的血管通透性改变及凝血功能障碍的机制研究

摘要

目的：本实验通过液压打击仪构建小鼠重度TBI模型，提前给予外源性重组人血管性血友病因子裂解酶（The recombinant human metalloprotease A Disintegrin And Metalloprotease with ThromboSpondin type1repeat13，rADAMTS-13），通过ADAMTS13对血管性血友病因子（von Willebrand factor，VWF）的水解作用，揭示提高VWF水解活性，可以减少并预防颅脑外伤（traumatic brain injury，TBI）后引起的血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）的破坏和系统性的凝血功能障碍；通过伤后注射rADAMTS-13证实其治疗作用，为TBI后继发性颅脑损伤防治提供新的策略。 方法：（1）利用小动物液压打击（fluid percussion injury，FPI）装置打击建立重型小鼠TBI模型，经鼠尾静脉分别于打击前和打击后注射rADAMTS-13观察其是否能降低死亡率，存活小鼠进行改良神经功能缺损评分（modified neurological severity score tests，mNSS）观察是否改善神经功能症状。（2）经鼠尾注射伊文思蓝（Evens blue,EB）染料，观察小鼠TBI模型鼠尾静脉注射rADAMTS-13能否减少血脑屏障的渗漏。（3）利用transwell构建体外BBB模型，验证VWF具有破坏BBB作用。（4）利用CASA/Rk背景的ADAMTS-13基因敲除小鼠(ADAMTS-13-/-)与其同窝小鼠分别经历FPI构建有和无ADAMTS-13水解作用的动物模型。（5）利用磷钨酸-苏木精（phosphotungstic acid hematoxylin，PTAH）染色观察小鼠肺组织的纤维素沉积。（6）利用苏木精伊红（hematoxylin eosin，HE）染色观察小鼠肺组织血管渗出情况。（7）利用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血浆中D二聚体、纤维蛋白原及VWF抗原的含量变化。（8）利用VWF结合胶原能力试验（Collagen binding assay，CBA）检测VWF粘附活力。（9）利用凝血因子Xa凝血时间实验和小鼠鼠尾静脉流血时间试验（mouse tail vein bleeding time）检测rADAMTS-13能否减少TBI后凝血功能紊乱的发生。（10）利用通过全血细胞计数（complete blood count，CBC）研究TBI后血细胞含量的变化。（11）利用流式细胞术检测TBI后血浆中各种微粒（microvesicles，MVs）的含量变化。（12）利用ELISA检测小鼠血浆内rADAMTS-13蛋白在TBI前后的含量变化。（13）利用western-blot技术验证MVs可以沾染VWF。（14）伤前和伤后鼠尾静脉rADAMTS-13蛋白研究使用rADAMTS-13蛋白治疗的可行性。伤前鼠尾静脉注射lactadherin以研究VWF与MVs结合情况。 结果：（1）FPI后可诱使小鼠损伤部位严重的血管渗漏和广泛的肺毛细血管的出血。（2）FPI后可导致小鼠系统性的消耗性凝血功能障碍，表现为血浆纤维蛋白原减少，D-Dimer增高以及凝血时间延长。（3）预先鼠尾静脉注射rADAMTS-13可以减少颅脑外伤引起的血管渗漏，预防消耗性凝血功能障碍的发生，而并不增加小鼠鼠尾静脉流血时间，从而改善FPI后神经功能症状，提高生存率。（4）PFI伤后急性期，小鼠血浆VWF抗原水平和粘附活性显著升高，于伤后3小时达到高峰，并且VWF粘附活性本身较VWF抗原水平升高更为明显。（5）预先鼠尾静脉注射rADAMTS-13在轻微减少FPI后VWF抗原水平的同时更主要的是降低VWF本身异常升高的粘附活性。（6）预先鼠尾静脉注射rADAMTS-13可减少由于FPI造成的血小板的异常激活。（7）在Transwell系统中，小鼠FPI后3小时血浆可以显著引起人脐带血内皮细胞（human umbilical cord vein endothelial cells,HUVECs）单层膜渗漏增加。（8）MVs而非贫微囊泡血浆（MV-free plasma，MVFP）可引起HUVECs单层膜渗漏并且这种作用可被VWF多克隆抗体所拮抗。（9）单纯VWF多聚体并不能使HUVECs单层膜渗漏增加。（10）VWF同时存在于FPI后小鼠血浆的MVs和MVFP中，而对于sham组小鼠，仅存在于MVFP中。（11）流式细胞仪测得的脑源性微粒（brain-derived microvesicles,BDMVs），血小板来源性微粒（platelet-derived microvesicles，PMVs）以及内皮来源性微粒（endothelial-derived，EMVs）数目在FPI后3小时达到最高峰。（12）FPI前预先鼠尾静脉注射lactadherin后，伤后小鼠血浆VWF抗原和粘附活性均显著下降。（13）同等强度FPI后，ADAMTS-13-/-小鼠血浆中VWF抗原水平和VWF粘附能力较C57BL/6J小鼠显著增加，同样在伤后3小时达到最高水平。（14）预先鼠尾静脉注射rADAMTS-13后，ADAMTS-13-/-小鼠受伤部位血管渗透性和消耗性的凝血功能障碍较未注射组明显减轻，可改善神经功能症状，取得良好的生存率。（15）FPI后30分钟鼠尾静脉注射rADAMTS-13可降低小鼠血浆VWF粘附活性而不影响VWF抗原水平，并且这种作用可被VWF抗体所拮抗。（16）FPI后30分钟鼠尾静脉注射rADAMTS-13可减轻FPI后导致的消耗性的凝血功能障碍和血脑屏障通透性的增加，减少血小板活化程度，从而改善神经功能，提高FPI后小鼠生存率。 结论：（1）FPI前预先鼠尾静脉注射rADAMTS-13可以预防性减少FPI后形成的血管渗透性增加和凝血功能障碍，改善预后。（2）FPI前预先鼠尾静脉注射rADAMTS-13可以预防性减少FPI后形成的小鼠血浆VWF粘附活性的异常活跃。（3）小鼠FPI后血浆VWF结合MVs，可破坏内皮细胞屏障功能的完整性，导致渗漏。（4）ADAMTS-13缺乏后FPI后造成的血管通透性增加和消耗性凝血功能障碍会加重。（5）rADAMTS-13具有治疗前景，将为TBI后继发性损伤的治疗提供新的治疗方向和理论基础。

目录

第一个书签之前

page1

RANGE!B13

RANGE!A16

OLE_LINK53

OLE_LINK379

OLE_LINK103

OLE_LINK152

OLE_LINK146

OLE_LINK3

OLE_LINK199

OLE_LINK321

OLE_LINK28

OLE_LINK50

OLE_LINK37

OLE_LINK40

OLE_LINK31

OLE_LINK415

OLE_LINK36