小鼠内毛细胞CME相关蛋白Myosin6-Dab2的表达研究

摘要

背景:
　　感音神经性聋的发病机制是神经生理及耳科学研究的热点方向[1]。听信号的传递依靠内毛细胞中数量众多的囊泡不断地量子化释放，借此保证突触间隙充足的递质能和突触后受体结合，进而引发听神经动作电位。稳定囊泡池(vesicle pool)中的囊泡数量需依赖IHC高效的囊泡循环再生[2]。囊泡循环(vesicle cycling)过程大体上可以分为囊泡释放（胞吐）和囊泡回收(内吞再生）两个主要环节[3]，高效的囊泡循环是内毛细胞正常突触活动的基础。
　　囊泡内吞(vesicle endocytosis)构成补充囊泡数量的必要条件，此外它还关乎着突触传递的可塑性、强度及学习记忆等过程。神经突触的囊泡同收模式众多，其中的网格蛋白介导的内吞(CME)对于稳定突触功能具有重要意义[4]。有关中枢神经系统研究发现，Myosin6蛋白为调控CME过程的马达蛋白，其通过分子尾端绑定信号蛋白Disabled-2(Dab2)，随即嵌入内吞所形成的囊泡凹陷结构中，借此锚定囊泡于微丝，继而利用ATP，为囊泡形成并沿微丝向胞内转运提供机械动力[5]。囊泡膜高水平Dab2蛋白为募集Myosin6参与CME过程的特征信号，其影响Myosin6功能的发挥及分子二聚体的半哀期[6]。
　　由于耳蜗结构复杂，细胞体外长时间培养尚未成功致使毛细胞囊泡相关研究进展缓慢。从细胞功能来看，现有的研究主要围绕带状突触结构及囊泡释放等环节，而释放出的囊泡膜是如何被回收至胞质中的，哪些蛋白参与内吞以及囊泡内吞在哪些亚细胞部位均有待揭示;另外，CME对毛细胞代谢过程的意义，CME与内毛细胞突触活动关系等问题迄今为止尚不明确。在分子功能方面，值得注意的是既往针对Myosin6分子力学特性的研究丰富，但有关耳蜗中的研究仅仅证实:1）该蛋白表达于耳蜗毛细胞，基因MYO6变异与表型为DFNA22、DFNB37（分别为常隐、常显）两型遗传性耳聋有关，2）根据胞内表达定位推测其功能为锚定纤毛;但既往理论并不能解释MYO6基因突变鼠IHC突触前膜形态改变、发育障碍、突触区囊泡数量变化及囊泡补充受损等现象[7]。Myosin6在毛细胞内的功能存在其他可能，且这些功能与听觉发育以及维持IHC复杂的生命活动有关。
　　目的:
　　1)本实验通过免疫荧光标记，激光共聚焦显微镜观察Myosin6及Dab2两个CME相关蛋白在KM小鼠耳蜗毛细胞的表达及定位;再以年龄为分组指标，分别采用图像分析软件及荧光qRT-PCR两种半定量方法研究比较出生后小鼠耳蜗中两个蛋白基因的表达水平变化趋势。基于蛋白自身特点，我们想探讨耳蜗IHC是否有类似的CME过程，CME过程的主要部位以及蛋白表达水平变化与听觉发育成熟的关系。
　　2)氯丙嗪能够抑制多种体外培养细胞的CME过程，而机制可能是通过钙调蛋白途径降低Myosin6的分子活性。本实验通过全细胞膜片钳比较了接受药物灌流细胞与正常细胞在钙电流Ica2+和膜电容△Cm两个方面的差异，以期探讨Myosin6功能抑制后，CME出现异常对IHC电生理活动的影响，证实正常CME对于维持细胞突触活动的重要性。
　　方法:
　　1.材料:实验用健康昆明(KM)小鼠共60只，分为四个年龄组（各组15只）:出生后2周龄、5周龄、9周龄、16月龄小鼠。实验用蛋白一抗购于Santa Cruz公司，荧光二抗购于Abbkine公司。荧光定量逆转录相关试剂购于Takara公司。
　　2.显微解剖并分离小鼠耳蜗基底膜。
　　3.免疫荧光染色制备基底膜铺片。
　　4.激光共聚焦显微镜观察（保持激发光波长以及检测器增益一致）。应用ZENlite2012(ZEISS)软件比较测定IHC核上区及核下区Myosin6蛋白荧光平均强度值(intensity mean value，IMV)以及不同年龄组内毛细胞Myosin6蛋白荧光IMV值。
　　5.qRT-PCR测定比较四个年龄组两蛋白mRNA的表达:抽提RNA并逆转录后进行定量PCR，测CT值。重复实验，并以Livak归纳方法计算相对表达量RQ值(relativequantity,RQ)，以9周龄小鼠作为对照组，比较其他三组与对照组两个蛋白mRNA相对表达量的差异。
　　6.ABR评估不同年龄组小鼠听阈值。
　　7.将IHC急性分离后，采用全细胞膜片钳检测对照组和氯丙嗪灌流组的钙电流和膜电容，比较差异。
　　8.统计分析:采用SPSS18.0软件，按照实验设计选用t检验或单因素方差分析进行，P＜0.05为差异显著。
　　结果:
　　1.免疫荧光染色结果（图1）:Myosin6、Dab2蛋白主要表达于耳蜗内外毛细胞，尤其在内毛细胞有着显著表达，而基底膜上其他细胞如支持细胞未见表达。通过软件比较后发现，Myosin6蛋白荧光在IHC核上区强于核下区。分层扫描后发现，IHC顶区Dab2强表达，即表皮板及局部胞质所在区域，而OHC中也存在局部高表达区。
　　2.比较各个年龄组蛋白荧光强度（图2、图3）:随机从每组Myosin6图像中选取5个IHC，截取其核上核下区2个等面积区域，ZENlite软件测算各区域IMV值。2周龄小鼠IHC区有斑点状荧光，强度明显低于其他三组，16月龄组Myosin6荧光强度IMV低于5周龄组及9周龄组(P＜0.01)，而5周龄组和9周龄组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。对比Dab2蛋白荧光图发现，各组均可见IHC顶区荧光局部增强区域，2周龄组Dab2荧光强度低于其他三组。
　　3.qRT-PCR半定量分析比较不同年龄小鼠蛋白mRNA表达:我们发现2周龄组两个蛋白的RQ值均小于9周龄组（P均＜0.05），而5周龄组和16月龄组两蛋白的RQ值分别与9周龄小鼠相比，两组差异均无统计学意义（P均＞0.05）。
　　4.ABR测试四个年龄组小鼠的听阈值:2周龄组结果未见稳定ABR波形。16月龄鼠ABR阈值分别较9周龄及5周龄鼠增高，差异均具有统计学意义（P均＜0.05），而5周龄和9周龄小鼠之间阈值差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　5.氯丙嗪灌流后，全细胞膜片钳初步检测发现，实验组内毛细胞内向钙流减弱，膜电容值下降。
　　结论:
　　1)根据CME相关两个蛋白的表达及Dab2蛋白于内毛细胞顶区存在的局部高表达区域，可以推测，内毛细胞存在CME过程，且这一过程在内毛细胞顶部更加高效、迅速，内毛细胞这一特点在某种程度上与极化的上皮细胞CME相似。内毛细胞顶部表皮板及附近局部胞质可能是胞外物质通过CME入胞的重要始发部位。
　　2)此外，生后早期，随着年龄的增长及听功能的逐渐发育成熟，Myosin6和Dab2蛋白表达呈增加的趋势;同时老年鼠听力损失可能与Myosin6蛋白表达下降有关。我们认为蛋白表达变化可以导致CME过程失调，而内毛细胞可能因此发生功能异常，进而影响正常的听觉功能。
　　3)电生理实验发现氯丙嗪可能改变IHC的电生理特性，如降低钙流及△Cm，说明CME对于保证IHC突触活动十分重要，而机制可能与Myosin6活动受抑引起CME障碍，最终导致IHC功能异常有关，但实验数据尚不完整，需要进一步完善。

目录

声明

英文缩写词表

摘要

第一章 前言

第二章 正常成年小鼠Myosin6及Dab2蛋白在耳蜗中的表达研究

2．1 实验材料

2．2 实验方法及实验步骤

2．3 结果

2．4 讨论

第三章 出生后小鼠耳蜗Myosin6及Dab2蛋白表达变化与听觉发育关系的研究

3．1 实验材料

3．2 实验方法及实验步骤

3．3 结果

3．4 讨论

第四章 Myosin6相关CME抑制剂氯丙嗪调控内毛细胞电生理的实验研究

4．1 实验材料

4．2 实验方法与实验步骤

4．3 结果

4．4 讨论

全文总结

参考文献

文献综述 Myosin6胞内功能的研究进展

硕士期间发表(含录用)的主要文章

致谢