恒定区结构域替换对TCR分子功能的影响

摘要

目的：通过探讨T细胞抗原受体（T cell receptor。TCR）分子的β、α双链恒定区结构域分别被免疫球蛋白IgG的重链C1区和轻链恒定区结构域替换后，其激活下游信号分子、活化T细胞能力的变化情况来确定改造后的TCR是否具有相应的生物学功能，用以证明这种恒定区结构域改造策略不仅可以使TCR基因修饰的T细胞（TCR-T）内所产生的外源TCR分子与内源TCR分子错配情况减少，而且恒定区结构域改造的TCR分子仍然有相应的生物学功能，为改善TCR基因修饰的T细胞过继性免疫治疗提供借鉴。
　　方法：
　　一、穿梭质粒载体pDC315-rβ-IRES-rα的构建
　　本实验室在前期工作中把经优势取用得到的TCR Vα12.2/Vβ7.1分子的双链恒定区结构域分别替换为IgG的轻链恒定区结构域和重链C1区，保留了两条链的抗原识别区、跨膜区和胞内区这样就形成了一种三明治形式的嵌合型TCR分子（chim-TCR），并利用IRES将其进行连接实现双链胞内共表达，两条链分别被黄绿色荧光蛋白和青色荧光蛋白标记后克隆到 pDC315载体上（pDC315-rβYFP-IRES-rαCFP），经过FRET分析表明其可以抑制杂合TCR分子的产生。为研究这种嵌合型TCR分子是否和野生型TCR分子一样具有相应的生物学功能，首先需要去除两种荧光蛋白，以防止其对 rβ、rα功能的影响。我们以载体 pDC315-rβYFP-IRES-rαCFP为基础，扩增嵌合型 TCR分子双链 rβ及IRES-rα，通过 EcoRI、NheI的酶切、连接反应构建过渡载体 pDC315-rβ；然后对pDC315-rβ及IRES-rα进行NheI、SalI双酶切，并连接为重组嵌合型腺病毒包装用穿梭质粒载体pDC315-rβ-IRES-rα，以进行后续嵌合型TCR分子生物学功能方面的研究。
　　二、重组嵌合型腺病毒Ad5/F35-rβ-IRES-rα的构建
　　利用Lipofectamine2000将Ad5/F35腺病毒骨架质粒pBHGIoxdeE1Cre与穿梭质粒pDC315-rβ-IRES-rα共转染HEK-293细胞，以包装携带嵌合型TCR基因的重组腺病毒载体；将获得的病毒转染7402细胞，提取总RNA，通过RT-PCR法获得c-DNA，以c-DNA为模板进行目的基因的扩增来检测重组嵌合型腺病毒是否构建成功；将鉴定正确的重组嵌合型腺病毒大量扩增后经TCID50法检测病毒滴度；按照MOI=100进行病毒转染淋巴细胞，通过流式细胞仪检测目的基因在淋巴细胞的表达情况。
　　三、嵌合型TCR分子生物学功能的鉴定
　　通过免疫印迹法对嵌合型TCR分子转导刺激信号、活化T细胞的能力进行检测，所检测的信号分子包括：PKC、Erk、NFAT的磷酸化与去磷酸化情况；通过荧光定量PCR对IL-2、IFN-γ的表达水平进行分析；通过ELISA检测细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌水平。
　　结果：
　　一、以本实验室前期构建的含有嵌合型 TCR分子的重组质粒pDC315-rβYFP-IRES-rαCFP为基础，成功构建了含嵌合型TCR基因的重组腺病毒穿梭质粒载体pDC315-rβ-IRES-rα。
　　二、将穿梭质粒 pDC315-rβ-IRES-rα和 Ad5/F35型腺病毒骨架质粒共转染HEK-293细胞，成功包装出重组嵌合型TCR腺病毒Ad5/F35-rβ-IRES-rα；利用RT-PCR在重组嵌合型TCR腺病毒中检测出目的基因rβ-IRES-rα；利用重组嵌合型TCR腺病毒感染淋巴细胞后，通过流式细胞术检测到嵌合型TCR分子的表达率为10％左右；TCID50法测得扩增后的重组嵌合型 TCR腺病毒滴度达到1.3×108IU/ml。
　　三、重组嵌合型腺病毒转染淋巴细胞并行特异抗体刺激，经荧光定量PCR、酶联免疫吸附法均检测到细胞因子 IFN-γ的变化较之于未转染淋巴细胞组有显著性的升高，而IL-2只有48小时的分泌水平于两组间具有显著性差异；蛋白免疫印迹检测到在经嵌合型TCR基因转染并接受特异抗体刺激的T淋巴细胞中，信号分子PKC、Erk的磷酸化与去磷酸化情况发生明显的变化，而NFAT的去磷酸化变化不明显。
　　结论：
　　所构建的嵌合型TCR分子以腺病毒为载体能成功转入淋巴细胞内，并得到有效表达；其激活淋巴细胞、传递活化信号至下游信号分子的能力得到有效保留；表明采用IgG的轻链恒定区与重链C1区分别替换TCR的α、β链恒定区结构域的策略是可行的，从而为改善TCR基因修饰的T细胞过继性免疫治疗提供了借鉴。

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英文摘要

前言

第一部分 穿梭质粒载体的构建

引言

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 结果

1.4 讨论

1.5 结论

第二部分 重组嵌合型腺病毒Ad5/F35的包装、鉴定与滴度测定

引言

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 结论

第三部分 嵌合型TCR分子活化T细胞能力的检测

引言

3.1 材料

3.2 实验方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 结论

参考文献

附录一英文缩略词表

附录二 质粒图谱

致谢