残留的偶极耦合在生物大分子溶液结构研究中的应用及人的MICAL-1蛋白的Calponin Homolgy结构域和BRD7蛋白的Bromodomain结构域的结构与功能研究

摘要

本论文的工作的重点是蛋白质的结构和功能的研究。论文分三个部分，首先，我们建立了应用残留的偶极耦合研究蛋白质结构的新方法，并把它用于蛋白质SH3BGRL3和MICAL-1 Calponin Homology(CH)结构域的结构研究中。然后，我们利用NMR方法研究了人的MICAL-1蛋白质的CH结构域的溶液结构，并推测了它的可能的功能。最后，我们利用NMR方法研究了人的BRD7蛋白Bromodomain结构域的结构，通过化学位移干扰的方法研究了它和组蛋白的结合，并利用突变实验加深了对它的结合特性的理解。 本论文第一章是残留的偶极耦合在生物大分子结构研究中的应用。在这一章中，我们首先从残留的偶极耦合理论、定向介质、脉冲序列、数据处理以及结构计算和其它应用等方面对残留的偶极耦合方法做了综述。然后，我们试验了几种不同的定向介质，建立了从定向介质到脉冲序列的应用，再到结构计算等一系列应用残留的偶极耦合的方法。最后，在Pf1噬菌体中，我们应用IP-AP[<'15>N，<'1>H]-HSQC测定SH3BGRL3蛋白的残留的偶极耦合，并进行结构计算，比较了使用残留的偶极耦合前后计算出来的结构的差异，我们的结果显示应用残留的偶极耦合作为约束能够提高结构的收敛程度减少RMSD和增加Ramachandran图中处于最好区域的残基的比例。 第二章是关于人的MICAL-1蛋白的CH结构域的结构和功能研究。先是对MICAL蛋白以及Calponin Homology结构域的一个综述。MICALs最初被发现可以与CasL相互作用，并因此而得名。MICALs还被发现可以在神经细胞中表达，并且能够与神经元的plexin A相互作用，参与到Semaphorin 1a诱导的轴突排斥导向过程中。最近的研究还表明MICAlLs可以与rabl GTP酶相互作用，参与囊泡的转运过程。MICALs有很多结构域，它的CH结构域的功能还不清楚。CH结构域是一类肌动蛋白结合结构域，但是它只与纤维状肌动蛋白结合。CH结构域主要是螺旋为主的结构，它除了能与肌动蛋白结合外，还可以与钙调蛋白结合或者参与信号转导的调控等。我们克隆表达了MICAL-1 CH结构域，利用核磁三共振实验方法，联合NOE和残留的偶极耦合方法，测定了它在溶液中的结构。MICAL-1 CH的空间结构是由六段α螺旋和1段3<,10>螺旋组成，约有67％的螺旋。这些螺旋之间通过很多疏水残基形成两个主要的疏水核心来维持整个蛋白的稳定。通过化学位移干扰实验，我们发现MICAL-1 CH不能和F-actin相互作用，通过序列比对，结构比较，．以及疏水表面的分析，解释了它不与F-actin相互作用的原因。最后，我们分析了MICAL-1 CH的可能的功能，即可能与微管蛋白相互作用，这还有待进一步证实。 第三章的工作是关于人的BRD7蛋白Bromodomain结构域的结构与功能的研究。首先足对BRD7蛋白以及Bromodomain结构域作的一个综述。Bromodomain是约110个氨基酸残基的结构域，含Bromodomain结构域的蛋白大多与染色质相关。Bromodomain可以特异性地与组蛋白N-末端乙酰化赖氨酸位点相结合，传递组蛋白乙酰化信号，介导染色质重构分子和组蛋白乙酰转移酶与染色质的有序结合，调控基因转录。BRD7是一个具有重要功能的蛋白，研究表明，它与鼻咽癌密切相关。BRD7对鼻咽癌细胞的生长有抑制作用。BRD7在鼻咽癌组织细胞中表达量明显下调；而且BRD7的过量表达能够抑制鼻咽癌细胞的生长。BRD7作为核转录因子，与EIB-AP5形成复合物物在核内发挥转录调控作用，并且形成E1B-AP5蛋白、BRD7和组蛋白的三元复合物。BRD7还可以与IRF-2(interferonregulatory factor)有相互作用。我们克隆表达了BRD7蛋白Bromodomain结构域，利用核磁三共振实验方法测定了它在溶液中的结构。BRD7 Bromodomain结构域包含5段α-螺旋结构和一段3<,10>螺旋，而没有β-折叠，与已知蛋白质的Bromodomain结构域相似。BRD7 Bromodomain的四段α螺旋，αZ、αA、αB和eC排列紧密，构成了Bromodomain特征的左手四螺旋束结构。通过化学位移干扰实验，我们发现Bromodomain不仅能够结合组蛋白H3 N-端K9和K14这两个乙酰化的化点，而且能够与组蛋白H4上K8、K12和K16这几个乙酰化的位点结合。通过拟合滴定曲线，我们还得到到了Bromodomain 与这些位点乙酰化的小肽的解离常数。另外，我们的突变实验表明，BRD7 Bromodomain上这些突变的位点与乙酰化的多肽上的那些残基的作用并没有别的Bromodomain蛋白中那么明显。BRD7 Bromodomain与乙酰化的小肽结合弱、选择性低是BRD7Bromodomain区别于其它Bromodomain的重要特点。

目录

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摘要

第一章 残留的偶极耦合在生物大分子结构研究中的应用

第一部分：综述

1.简介

2.理论

3.定向介质

4.残留的偶极耦合的测定

5.偶极耦合数据的分析

6.残留的偶极耦合在生物大分子结构测定中的应用

7.总结

第二部分：材料和方法

1.定向介质的制备

2.脉冲序列

3.数据处理

4.结构计算

第三部分：实验结果和讨论

1.定向介质比较

2.脉冲序列的选用

3.数据处理和结构计算

4.小结

参考文献:

第二章 MICAL蛋白 CH结构域的溶液结构研究

第一部分：综述

1.MICAL蛋白的简介

2.CH结构域的来源及含CH结构域蛋白的分类

3.CH结构域的结构特点

4.CH1和CH2结构域组成的actin结合结构域

5.单独地CH2类结构域

6.其它几类蛋白质家族

7.总结

第二部分：材料和方法

1.MICAL-1的CH结构域的克隆、表达和纯化

2.15N标记和15N，13C双标记重组人MICAL-1 CH蛋白质的制备

3.NMR实验与结构计算

第三部分：结果和讨论

1.MICAL-1 CH 的化学位移认证

2.MICAL-1 CH 的氢氘交换实验

3.残留的偶极耦合实验

4.MICAL-1 CH 的蛋白质的结构计算和结构描述

5.MICAL-1 CH 的结构与其它CH结构域的结构比较

6.MICAL-1 CH 的不能独自与F-actin作用

7.MICAL-1 CH 的可能的功能

参考文献:

第三章人的BRD7蛋白Bromodomain结构域的结构与功能

第一部分：综述

1.Bromodomain的分类和结构

2.Bromodomain的配基选择性

3.Bromodomain的功能

4.BRD7蛋白的功能

5.研究BRD7蛋白Bromodomain的意义

第二部分：材料和方法

1.人BRD7蛋白Bromodomain结构域的克隆表达

2.NMR实验与数据变换

3.主链认证及侧链化学位移的认证

4.结构计算

5.化学位移干扰实验

6.BRD7 Bromodomain突变体的制备

第三部分：结果和讨论

1.BRD7Bromodomain的化学位移认证

2.BRD7 Bromodomain的氢氘交换实验

3.结构计算和结构描述

4.与其它Bromodomain的序列和结构比较分析

5.与来自组蛋白 H3和 H4的小肽相互作用

6.突变结果分析

7.总结

参考文献:

致谢

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