腹盆腔放疗模拟照射小鼠肠道微生态的变化与肠炎发生的实验研究

摘要

随着工业化时代的到来，现代人的生活节奏加快，环境的污染以及生活方式的改变，导致癌症的发病率持续上升。根据国际癌症研究中心报告:未来几十年内，癌症发病人数仍将快速增长，预计2030年全球将有2，136万癌症新发病例。其中腹盆腔肿瘤患者占相当大的比例。当前，传统手术、化疗和放疗三大技术仍然是全球医疗机构采用的主要肿瘤治疗方法。放射治疗（放疗）是肿瘤患者选用的重要治疗手段之一。据不完全统计，全球约有45％的恶性肿瘤患者接受放疗。然而，由于放疗对癌细胞和正常细胞没有分辨能力，放疗时常会产生一定的毒副作用。鉴于腹盆腔的特殊解剖结构，结直肠癌、宫颈癌等患者接受放疗时，不可避免地使正常肠组织遭受不必要照射。由于肠道对电离辐射比较敏感，约40％腹盆腔肿瘤放疗患者会遭受不同严重程度的放射性肠炎。放射性肠炎的发生不仅影响肿瘤的有效治疗，同时影响患者的心理和生活质量。然而，放射性肠炎发生的机制尚未完全阐明。
　　新近研究表明，人和哺乳动物的消化道是一个特殊的微生物库，拥有1，000多种微生物(1014 CFU)。正常情况下，肠道菌群、宿主和外部环境因子建立起动态的生理平衡，对机体的健康发挥着重要的调节作用。然而，当受到一些特殊刺激时，肠道菌群与机体之间的相互作用平衡可能被打破，引发肠道菌群失调，诱发肠道粘膜免疫失衡甚至导致局部或全身性病理反应。那么，腹盆腔放疗病人出现的食欲下降，恶心呕吐，腹胀腹痛，腹泻或便秘，甚至放射性肠炎等消化道不良并发症是否与辐射引起的肠道微生态失调有关呢？
　　既往研究表明，遭受较大剂量(＞10Gy)电离辐射全身急性照射后，约50％的小鼠死于肠源性感染。可能是异常增殖的条件致病菌穿透破损的肠粘膜屏障进入机体，诱发了肠源性感染的发生，甚至引起败血症。那么，较小剂量（2Gy/天）多次局部放疗照射是否也会引起肠道粘膜上皮的不良反应，甚至诱发肠粘膜的炎症反应尚未见报道。如果放疗诱发了放射性肠炎，其与肠道微生态失调间是否存在因果关系呢？
　　在生理状态下，肠粘膜具备有效抵抗细菌入侵的免疫屏障。肠粘膜免疫包括肠上皮细胞及其和杯状细胞等分泌的粘液形成的机械屏障，还包括潘氏细胞、巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞分泌的多种免疫活性分子。其中分布于小肠腺底部的潘氏细胞表达、分泌的多种抗菌肽在调控肠道菌群，抵抗细菌入侵方面发挥着至关重要的作用。然而，放疗照射是否引起了肠道防御素表达的改变，其变化特点及发生机制与肠道菌群失调间的关系如何等，均缺乏较深入的研究。
　　因此，本课题以复制模拟腹盆腔放疗照射小鼠模型，首先采用菌群16s RNA宏基因组测序分析放疗进程中小鼠肠道微生态的变化特点，同时检测照射小鼠肠道组织和血清中炎症因子的表达状况，并分析肠道菌群改变与炎症反应间的关联性;然后检测肠道上皮凋亡状况和潘氏细胞自噬特点及其表达抗菌肽的变化特征，以探讨放疗照射诱发肠道微生态失调与放射性肠炎发生的机制。主要研究结果与结论如下：
　　1.参照腹盆腔肿瘤病人的临床放疗方案，成功建立腹盆腔放疗模拟照射小鼠模型，发现受照小鼠在放疗照射进程中的采食量和活动量减少，并伴腹部不适、排软便等症状及体重减轻状况。
　　2.采用菌群16s RNA宏基因组测序发现，放疗照射过程中小鼠小肠和粪便菌群的丰度和多样性均出现显著性降低，连续放疗照射6周时最为严重。证实了临床放疗辐射可诱发肠道微生态失调。
　　3.宏基因组测序结果揭示了正常小鼠粪便菌群的主要菌门为厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门（总丰度＞98％）的特点。发现了在放疗进程中，小鼠肠道微生态出现厚壁菌门丰度显著减少，拟杆菌门明显增多的特点，即厚壁菌门/拟杆菌门的丰度比倒置的现象。放疗进程中小鼠肠道菌群在菌门水平上发生着明显的异常变化。
　　4.菌群基因组分析表明，放疗照射进程中小鼠肠道菌群在科和属的水平上发生着显著性变化，揭示出放疗引起志贺氏菌、肠杆菌、葡萄球菌和链球菌等条件致病菌丰度显著增加，而乳杆菌等益生菌含量明显降低，整个肠道菌群的定植抗力明显减弱的特点。
　　5.细菌DNA检测结果表明，照射小鼠肠系膜淋巴结和血液中的细菌DNA阳性率明显上升。提示放疗照射提高了肠源性感染的发生率。
　　6.定量PCR结果显示，放疗照射过程中小鼠回肠促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平明显升高。蛋白芯片结果表明受照小鼠TNF-α、IL-1β、MCP-1、KC、LIX水平和血清LPS含量随放疗照射剂量增加而明显上升。揭示了放疗照射可诱发小鼠肠道局部和全身性的炎症反应的发生。
　　7.相关性分析发现，照射小鼠血清LPS浓度与显著升高的肠道大肠杆菌丰度密切相关，血清TNF-α和IL-1β浓度与大肠杆菌丰度呈中度相关，表明受照小鼠伴发的炎症反应与以大肠杆菌异常增多为特点的肠道菌群失调相关。
　　8.定量RT-PCR和免疫组化结果显示，放疗照射过程中肠道防御素的表达呈现明显波动变化，提示抗菌态的表达紊乱可能是引起肠道微生态结构和组成发生异常的原因。
　　9.研究发现放疗照射诱发了肠道上皮细胞凋亡增高、隐窝潘氏细胞自噬增强，提示电离辐射诱发了潘氏细胞的免疫功能紊乱，肠道上皮细胞与肠道菌群相互作用失衡可能是放疗照射引起肠道感染及炎症反应的机制。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

1．1 选题依据

1．2 研究背景

1．3 研究意义

1．4 研究内容

1．5 研究方法

第二章 腹盆腔放疗模拟照射对小鼠肠道微生态的影响

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 腹盆腔放疗模拟照射小鼠肠炎发生的特点及机制初探

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 小结

全文总结

参考文献

文献综述 防御素调节腹盆腔放疗肠道微生态失调的研究进展

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢