αA晶体蛋白对视神经损伤后星形胶质细胞和RGCs轴突的作用及机制研究

摘要

由外伤、缺血、青光眼等导致的急性视神经损伤(optic nerve injury)是眼科常见的损伤类型，约占颅脑外伤的2％～5％，也是神经性致盲重要原因之一，迄今仍缺乏有效的治疗手段。视神经损伤修复与再生途径及其机制研究已成为当前神经科学的热点，也是眼科临床迫切需要解决的问题。视神经损伤后难以再生，其原因有神经损伤后Caspase-3、RhoA/Rock、Nogo-A等凋亡信号的激活以及去靶细胞提供的营养物质丢失导致视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)继发性凋亡，视网膜和视神经胶质细胞的反应性增生形成胶质瘢痕使RGCs轴突难以穿透。另外，反应性增生的胶质细胞还会释放一些细胞外基质成分如硫酸软骨素酸性糖蛋白(CSPGs)形成抑制微环境，进一步抑制轴突再生和延长。
　　促进RGCs轴突再生的主要办法有补充外源性神经营养因子如脑源性神经生长因子(BDNF)、睫状神经生长因子(CNTF)、神经生长因子(NGF)等，但这些外源性因子的补充只能维持RGCs的短暂存活，对轴突的再生作用效果较小;干扰凋亡信号通路如Caspase、RhoA/Rock、Nogo-A等虽然可以减少RGCs凋亡，但并不能增强轴突再生能力;通过抑制胶质细胞的活化以减少胶质瘢痕的形成和微环境产生，这虽然有利于轴突的再生，但对RGCs轴突的存活和再生数量难以保障。以上各种干预方法均未能达到有效促进RGCs轴突长距离生长和功能性恢复的效果。由此可见，视神经损伤后轴突的再生的障碍是多环节多因素共同作用的结果，寻找具有多靶点作用的分子及综合干预将是研究视神经损伤后功能性再生的重要方向之一。
　　α晶体蛋白(alpha crystallin)是小分子热休克蛋白家族(small heat shock protein，sHsp)的一员，分为A型和B型。已有研究证实，α晶体蛋白作为应激性蛋白在抗炎、抗凋亡、抗蛋白聚集等方面发挥着重要作用，在视神经损伤方面对RGCs的存活和轴突再生具有非常好的生物学效应。研究发现，在视神经横断模型中，损伤的晶状体能刺激RGCs轴突的再生，且生长锥能到达位于上丘的视皮层.α晶体蛋白能通过RhoA/Rock信号通路促进RGCs的存活和轴突的生长，也能通过抑制小胶质细胞的激活和炎性因子TNF-α及iNOS的释放保护节细胞的存活。这些研究提示α晶体蛋白可能是一个具有多靶点作用的分子。我们的前期研究发现，αA晶体蛋白和αB晶体蛋白均能够影响离体培养的脑源性星形胶质细胞的活化和增殖，细胞划痕实验也证实αA晶体蛋白或αB晶体蛋白处理后，星形胶质细胞的迁移明显被抑制，但αA晶体蛋白的效果更显著。但具体原因尚不清楚。
　　BMP/Smad是调控中枢神经系统胶质细胞增殖、分化的关键信号通路。在脊髓损伤后，BMP2/4/7和pSmad1/5/8在少突胶质细胞、星形胶质细胞中的表达明显增高。细胞培养提示，BMP4能促进神经干细胞分化成星形胶质细胞，当给予BMP4抑制剂Noggin后，星形胶质细胞的生成数量明显减少。以上研究均证实BMP/Smad参与星形胶质细胞的活化、增殖、分化。在体外培养的视乳头区星形胶质细胞缺氧复氧的刺激后，BMP和BMPR的基因表达和蛋白水平均明显增加，星形胶质细胞反应性增生，同时可检测到α晶状体蛋白表达增加，但两者的相互关系尚不明确。
　　基于以上研究的背景我们提出如下假设:视神经损伤后反应性增生的星形胶质细胞被激活并形成的胶质瘢痕和抑制轴突再生的微环境是轴突难以再生的关键因素。αA晶体蛋白能减轻胶质瘢痕的形成和影响抑制微环境从而促进轴突的再生并改善视功能。而且αA晶体蛋白可能是通过BMP/Smad信号通路而发挥作用。为此，在体内实验中，我们建立大鼠视神经不完全损伤模型，同时给予玻璃体腔注射αA晶体蛋白(10-4g/l，4ul)，对照组给予同等剂量的PBS注射，运用IHC和WB技术观察术后1天，3天，5天，14天视网膜和视神经GFAP表达变化，用同样技术方法观察术后14天TUJ1、GAP-43、CSPGs、Neurocan蛋白的表达变化，了解αA晶体蛋白对胶质瘢痕形成和轴突再生的影响。离体实验中，分离培养视神经星形胶质细胞，通过划痕实验、糖氧剥夺(OGD)实验观察αA晶体蛋白对星形胶质细胞迁移和激活的影响。通过RT-PCR检测BMP/Smad信号分子的mRNA水平探讨αA晶体蛋白影响星形胶质细胞活化的可能机制。为αA晶体蛋白下一步研究与运用提供更有力理论支撑。
　　本研究包含三个部分
　　第一部分、SD大鼠视神经不完全损伤后RGCs的变化及视网膜和神经损伤区星形胶质细胞活化的观察
　　采用视神经轻度夹伤办法建立视神经不完全损伤模型。我们观察到视神经损伤后3天RGCs即发生明显的凋亡，损伤后14天RGCs的凋亡接近52％。视网膜和视神经星形胶质细胞被激活，术后1天GFAP表达即明显增加，于术后14天时GFAP的表达达到最高水平。在视神经损伤区，星形胶质细胞大量的活化、增殖和迁移进入损伤区形成致密的胶质瘢痕。同时，电生理F-VEP的N1-P1幅值降低（5.24±1.67uV）和P1潜伏期延长（126.75±8.94ms），提示视神经损伤后RGCs减少、胶质细胞活化、视功能严重受损。
　　第二部分:玻璃体腔注射αA晶体蛋白对视神经损伤后星形胶质细胞活化和RGCs轴突再生的影响。
　　视神经损伤后玻璃体腔注射αA晶体蛋白(10-4g/l，4μl))，对照组给予同等剂量的PBS注射。我们通过IHC和WB观察视神经损伤区星形胶质细胞的形态和GFAP、CSPGs、Neurocan、TUJ1、GAP-43的表达变化发现:αA晶体蛋白能明显抑制视神经损伤区周围的星形胶质细胞的活化和迁移，从而抑制胶质瘢痕的形成。引导损伤区星形胶质细胞的重排，同时可以减少轴突再生主要抑制物CSPGs和Neurocan的表达。通过检测TUJ1和GAP-43的水平，发现αA晶体蛋白能够有效保护视神经TUJ1阳性突触的存活，促进RGCs轴突的再生并使再生轴突穿过损伤区。F-VEP检查发现，与对照组相比，αA晶体蛋白能有效改善视神经损伤后大鼠F-VEP的N1-P1的幅值（对照组:5.83±2.64μV治疗组:12.02±1.64μv）和P1的潜伏期（对照组:126±9ms治疗组:100±9ms），使部分视神经功能恢复。
　　第三部分:αA晶体蛋白影响视神经星形胶质增殖的分子机制研究
　　为进一步探讨αA晶体蛋白影响视网膜星形胶质细胞的可能分子机制，我们对视神经星形胶质细胞进行分离培养。运用差速贴壁法获得纯度较高的视神经星形胶质细胞，运用细胞划痕实验观察αA晶体蛋白(10-4g/l)对星形胶质细胞迁移的影响。结果显示αA晶体蛋白能够抑制星形胶质细胞的迁移。
　　利用糖氧剥夺模型（Oxygen-Glucose Deprivation，OGD）成功模拟视神经夹伤后的视神经损伤区星形胶质细胞的活化。将细胞分为对照组、OGD组、OGD+BSA组、OGD+αA晶体蛋白治疗组。细胞免疫荧光(ICC)和WB分析GFAP和Neurocan的表达变化，发现OGD能刺激星形胶质细胞活化，使GFAP和Neurocan的水平升高，当给予αA晶体蛋白（10-4g/l）处理后，GFAP和Neurocan的水平明显被抑制，观察结果与体内实验结果相一致。我们通过对BMP/Smad各节点信号分子的基因表达检测发现，αA晶体蛋白能抑制BMP2、BMP4及Smad1、Smad8的mRNA表达。结果提示，αA晶体蛋白可能通过BMP/Smad信号通路抑制视神经星形胶质细胞GFAP的表达和Neurocan的分泌。
　　结论:
　　1.视神经损后，一方面由于RGCs失去靶细胞提供的营养物质、凋亡信号通路的激活发生继发性凋亡，另一方面视神经损伤刺激视网膜和视神经星形胶质细胞活化形成胶质瘢痕，使RGCs轴突难以存活和再生。我们通过αA晶体蛋白玻璃体腔注射治疗发现αA晶体蛋白不仅能保护RGCs轴突的存活，使部分F-VEP波形恢复，改善视神经传导功能，还能有效抑制星形胶质细胞的活化和增殖，引导星形胶质细胞的重排，减弱胶质瘢痕的形成和减少抑制性分子CSPGs、Neurocan的表达，从而促进轴突的再生并使再生轴突穿过损伤区。这些发现，证实αA晶体蛋白是一种具有多靶点作用的分子，对视神经损伤后神经修复的治疗具有广阔的运用前景。
　　2.αA晶体蛋白通过抑制星形胶质细胞的活化促进轴突的再生很少有人报道，本实验首次观察到，αA晶体蛋白可能通过BMP/Smad信号通路调节视神经星形胶质细胞的增殖、活化从而促进RGCs轴突的生长。

目录

声明

缩略词表

摘要

第一章 前言

第二章 SD大鼠视神经不完全损伤后RGCs的变化及视网膜和神经损伤区星形胶质细胞活化情况的观察

2．1 视神经损伤后视网膜RGCs和GFAP的表达变化观察

2．2 视神经损伤后神经损伤区GFAP的表达变化观察

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 玻璃体腔注射αA晶体蛋白对视神经损伤后星形胶质细胞活化和RGCs轴突再生影响的观察

3．1 玻璃体腔注射αA晶体蛋白对视神经损伤后星形胶质细胞活化的影响

3．2 玻璃体腔注射αA晶体蛋白对视神经损伤后RGCs轴突再生的影响

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 αA晶体蛋白影响星形胶质细胞增殖的分子机制研究

4．1 视神经星形胶质细胞原代培养和鉴定

4．2 αA晶体蛋白对视神经星形胶质细胞迁移的影响

4．3 αA晶体蛋白对OGD处理后星形胶质细胞增殖的影响

4．4 αA晶体蛋白影响星形胶质细胞增殖的分子机制研究

4．5 讨论

4．6 小结

全文结论

参考文献

文献综述 α晶体蛋白对神经系统损伤的修复作用研究进展

攻读学位期间发表的论文

致谢