胶质限制性前体衍生的星形胶质细胞移植以促进轴突生长

摘要

本文提供了用于治疗受试者中枢神经系统(CNS)病灶的组合物和方法，包括给予胶质限制性前体(GRP)衍生的星形胶质细胞(GDAs)。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2005年8月26日提交的美国申请系列No.60/711,498 和2005年8月29日提交的美国申请系列No.60/712,044的优先权。

关于联邦资助研究的声明

本发明获得National Institutes of Health资助号为RO1 NS04642和 RO1 NS42820的政府支持。政府对本发明享有某些权利。

背景技术

成年中枢神经系统(CNS)的外伤性损伤与多种损害类型相关，它 们都对组织修复提出相当大的挑战。促进断开的(severed)运动及感觉 轴突的再生生长需要供应适宜的基质和/或克服多种阻止轴突再生的抑 制剂。轴突生长的分子抑制剂的表达在胶质瘢痕组织(glial scar tissue) (Bundesen，et al.，J.Neurosci.23：7789-800 2003；De Winter，et al.，Exp. Neurol.175：61-75 2002；Moreau-Fauvarque，et al.，J.Neurosci.23：9229-39 2003；Tang，et al.，J.Neurosci.Res.71：427-44 2003)以及在CNS髓鞘 (Chen，et al.，Nature 403：434-9 2000；McKerracher，et al.，Neuron 13：805-11 1994；Wang，et al.，Nature 417：941-42002)中都已被广泛地表 征。损伤也与正常组织结构的物理破坏以及与紊乱瘢痕组织的产生相关 (Berry，et al.，Acta Neurochir.Suppl.32：31-53 1983；Windle，et al.，J. Comp.Neurol.96：359-69 1952)，该紊乱瘢痕组织缺少被认为是长距离 轴突生长所需的成年CNS白质的线状结构体(Davies，et al.，J.Neurosci. 19：5810-22 1999；Davies，et al.，Nature 390：680-3 1997；Davies，et al.，J. Neurosci.14：1596-1612 1994；Pettigrew，et al.，J.Neurosci.19：8358-66 1999)。

多种方法已被用于促进感觉及运动轴突的再生生长，尤其集中在多 种细胞类型的移植，其通常与其它治疗组合。用于促进轴突生长穿过脊 髓损伤的基于细胞的移植策略(Reier，et al.，Neurorx.1：424-512004)包 括了使用雪旺细胞、嗅鞘细胞、神经干细胞、新生脑星形胶质细胞和骨 髓源性细胞。细胞移植策略也已与递送神经营养因子(拮抗或降解瘢 痕的生物活性物质)，以及与使用生物材料相结合以提供可能的基质和 组织化的组织结构，其导致轴突再生在不同程度上的成功(Bunge，et al.， Neuroscientist 7：325-392001)。然而，多种细胞类型直接移植入外伤性 脊髓损伤处或其邻近处没有导致很多内源性轴突再生穿过损伤位点 (Han，et al.，Glia 45：1-16 2004；Hill，et al.，Exp.Neurol.190：289-310 2004；Hofstetter，et al.，Nat.Neurosci.8：346-53 2005；McDonald，et al.，Nat. Med.5：1410-12 1999)。

发明内容

本文提供了组合物和方法，用于治疗脊髓损伤或中枢神经系统 (CNS)的其它外伤或退行性病症、促进轴突再生、遏制星形细胞胶质 化(astrogliosis)、重新排列宿主组织以及延缓轴突生长抑制性蛋白多 糖表达。因此，提供了治疗受试者CNS病灶(lesion)的方法，包括给 予病灶包含胶质限制性前体(GRP)衍生的星形胶质细胞(GDAs)的 组合物。

附图简要说明

附图被引入并组成本说明书一部分，其阐明了所公开方法和组合物 的若干实施方式，且和说明书一起用于解释所公开方法和组合物的原 理。

图1A，1B和1C示出背柱(图1A和1B)和背外侧索(图1C)病 灶模型。图1A示出颈髓的水平面。右侧背柱白质在C1/C2脊髓水平产 生病灶并且GDAs直接移植(◆)入病灶中心以及嘴侧和尾侧病灶缘内。 图1B示出颈髓的矢状面。检测生物素化葡聚糖胺(BDA)标记的内源 性轴突或者来自微植入的表达绿色荧光蛋白(GFP)的成年感觉神经元 (DRGs)的轴突跨植入GDA的病灶的能力。图1A中的阴影框或者图 1B中的梯形表示病灶位点。Cf，楔束；Gf，薄束；CST，皮质脊髓束； CC，中央管；gm，灰质。图1C示出在C3/C4脊髓水平产生病灶的右侧 背外侧索。按照所述为背柱病灶移植GDAs。为了示踪切掉轴突的 (axotomized)红核脊髓束轴突，BDA在实验终点前8天注射到左侧红 核(RN)。

图2是图表，示出在损伤/移植后第8天，植入GDA的背柱白质中 再生BDA+轴突数量的量化，与对照相比较。BDA标记的轴突在病灶中 心内的每3个矢向切片中、在损伤位点嘴侧0.5mm、1.5mm和5mm的 点、直到且包括背柱核处计数。注意到61％的BDA+轴突到达植入GDA 的病灶中心且39％到达超出损伤位点0.5mm，相比之下，对照中出现的 仅为4％(病灶中心)和3.8％(嘴侧0.5mm)。对照中嘴侧5.0mm和 DCN完全没有轴突以及在嘴侧白质内BDA+轴突数量稳步下降表明植 入GDA组中交错的轴突生长超出损伤位点。所有嘴侧脊髓区域中，经 GDA处理的动物相比于对照BDA+轴突数量的增加具有统计学显著性 (p＜0.01)。误差条+/-1个标准差。dcn，背柱核。

图3示出在损伤/移植后第8天，内源性感觉轴突再生穿过移植了 GDA的背柱损伤。子图(a)是从一个厚25μm的矢状切片扫描的经剪 辑的低倍放大共聚焦图像，示出长入、在其内生长并长出移植了 hPAP+/GDA的背柱病灶的BDA标记的感觉轴突。LC，病灶中心。子图 (b)是嘴侧移植物/宿主界面的高倍放大图像，示出GDA移植物长出并 进入宿主白质的BDA+轴突。观察到一些轴突离开界面并且返回病灶中 心(箭头)生长。子图(c)示出在对照病灶中，大多数BDA+轴突没能 离开尾侧病灶缘(由肥大GFAP+星形胶质细胞指出)，并且形成了营养 不良的末梢。子图(d)是高倍放大的图像，示出在尾侧病灶缘成功地 穿过宿主/移植物界面的大量BDA+轴突。一些切伤的轴突(箭头)没有 离开尾侧病灶界面并显出回转的和/或营养不良的末梢，尤其在不含 hPAP+/GDA的区域。子图(e)示出位于近软膜表面以及楔形白质腹侧 区域GDA桥接病灶位点嘴侧1.5mm处的BDA+轴突。子图(f)示出 BDA+轴突生长椎在病灶位点嘴侧1.5mm白质中经常显示流线型生长 椎，表现出快速生长。比例尺：a，c，100μm；b，d，e，50μm；f，5μm 和10μm。

图4示出在损伤/移植后第8天，比较GDA和GRP移植以促进轴突 从邻近的微植入成年感觉神经元生长穿过背柱损伤。子图(a)是从一 个厚75μm的矢向切片扫描的经剪辑的共聚焦图像，示出长入并长出以 hPAP+/GDA桥接的背柱病灶的GFP+轴突。子图(b)示出在GDA移植 体没有充分填满损伤位点或迁移入病灶缘的两种情况下，GFP+感觉轴突 没能穿过尾侧病灶缘，反而形成与对照未处理的损伤中相同的营养不良 的末梢。LC，病灶中心。子图(c)是共聚焦剪辑，示出植入的GRPs 完全没能支持GFP轴突生长穿过背柱损伤。值得注意的是，尽管植入的 GRPs有跨越损伤位点的能力，但大部分GFP+轴突在尾侧病灶缘形成了 营养不良的末梢。比例尺：a，300μm；b，100μm；c，200μm。

图5A示出病灶缘的GDA重整(reorganization)。对照病灶在损伤 后第4天(子图(a))且尤其是第8天(子图(c))在病灶缘内显示 内源性星形胶质细胞肥大胞体和突起(process)的致密网络，这是形成 胶质瘢痕组织的特点。子图(b)示出损伤/移植后第4天，hPAP+GDAs“闪 光斑”与重新排列的宿主GFAP+星形胶质细胞在病灶缘内(示出了尾侧 缘)交织。植入的GDAs和宿主星形胶质细胞的突起都指向病灶中心。 注意的是，hPAP+GDAs不是GFAP+。子图(d)示出在损伤/移植后第8 天，相比于对照子图(c)，GDAs引起了宿主星形细胞胶质化的减少以 及宿主GFAP+星形胶质细胞的明显重新排列。

图5B是图表，示出宿主GFAP+突起在病灶缘排列的量化。在对照 (n＝100)和植入GDA的病灶缘(n＝100)，测量的每对GFAP+突起之 间的角度在柱状图中图示显示。沿x轴的每格表示一对突起之间角度差 别的程度。0°是平行，90°是垂直。y轴表示每格内GFAP+突起对的数目。 值得注意的是，与对照相比，在植入GDA的病灶缘中，GFAP+宿主星 形胶质细胞突起排列有明显差别。植入GDA的病灶在成对的突起之间 具有平均角度仅仅11.6°(中值7°)，与之相对，对照病灶缘为59.4°(中 值61°)。统计分析：p＜0.0001，t-检验。比例尺a，c，d，100μm；b， 50μm。

图6示出GDA移植遏制神经蛋白聚糖和NG2免疫反应性。子图(a) 示出在损伤后第4天，对照病灶缘显示主要与细的GFAP-突起相关，其 次与GFAP+星形胶质细胞胞体相关的致密的神经蛋白聚糖免疫反应性。 子图(b)示出在损伤/移植后第4天，神经蛋白聚糖免疫反应性在植入 hPAP+GDA的病灶缘大大降低。子图(c)示出在损伤/GDA移植后第8 天，病灶缘内的神经蛋白聚糖免疫反应性相比于第4天时间点有所提高。 然而注意的是，病灶内部hPAP+GDAs仍是非神经蛋白聚糖免疫反应性 的。子图(d)，(e)和(f)示出植入GDA的病灶中心(子图(e)和 (f))在损伤后第4天显示NG2免疫反应性相比于对照病灶(子图(d)) 显著降低。子图(g)，(h)和(i)示出尽管在植入GDA的病灶中心 内的整体NG2免疫反应性在损伤后第8天(子图(h)和(i))相比于 第4天时间点(子图(e)和(f))有所提高，但其比损伤后第8天在 对照病灶中心内更均一分布的NG2免疫反应性有所降低。比例尺：a，b， g，100μm；c，h，i，50μm；d-f，200μm。

图7示出移植的GDAs促进红核脊髓轴突的再生。子图(a)是从 深度60μm扫描的共聚焦剪辑，示出损伤后第8天少量BDA标记的红核 脊髓束(RST)轴突，其已横跨GDA桥接的背外侧索病灶并进入尾侧 白质。然而大部分RST轴突在病灶中心(LC)300μm内出芽，但没能 延伸超出损伤位点。值得注意的是，在损伤位点的背侧大部分区域内没 有BDA标记的轴突。子图(b)是共聚焦剪辑，示出切掉轴突的BDA+RST 轴突完全没能穿过对照病灶并且大部分轴突保留在距病灶中心(LC) 500～800μm的嘴侧病灶缘内。存活，8天。子图(c)示出损伤/移植后 第5周，与在第8天观察的相类似，小群的BDA+RST轴突横跨GDA 桥接的损伤位点并在尾侧白质内延伸，然而，BDA+轴突也出芽进病灶 中心背侧区域甚至延伸超出软膜表面(箭头和子图(d))。注意在损 伤缘和中心更腹侧区域的更低水平GFAP免疫反应性与BDA+轴突的存 在相一致。子图(e)示出RST轴突的两个实例，其在GDA处理的损伤 尾侧2mm白质内显示生长锥；存活5周。注意旁枝(*)。子图(f)是 在第5层脊髓灰质内BDA+末端域样(field-like)轴突丛的共聚焦图像， 紧邻背外侧索。比例尺：a，b，c，200μm；d，100μm；e，5μm；f，10μm。

图8示出GDA移植遏制红核神经元萎缩并促进稳健的行为复原。 图8A是图表，示出对照大鼠损伤的左半球红核平均含有在未损伤的右 半球红核中计数的52％的神经元。然而，在植入GDA动物的损伤的左 半球红核中神经元数量升高至未损伤右半球核中神经元数量的81％。损 伤后存活5周(^*p＜0.01)。图8B是示出运动恢复的Gridwalk分析的 图表。图表示出每个实验组在损伤后不同时间点的平均错误数。

图9示出轴突生长与病灶缘中的GDAs以及宿主星形胶质细胞突起 平行排列。子图(a)(左)是大量长出子图3a所示背柱病灶的嘴侧宿主/ 移植物界面的GFP+轴突的高倍放大图像。子图(b)示出GFP+轴突与 尾侧病灶缘内宿主GFP+星形胶质细胞突起平行排列。比例尺：a，50μm； b，c，25μm。

图10示出GDA在体内表达星形细胞标志物。损伤/移植后第4天， 背柱病灶中心和病灶缘内的大部分hPAP+GDAs显示对S100(子图(a) 和(b))和波形蛋白(子图(d)和(e))的免疫反应性。通过深度 2.5μm的连续扫描的共聚焦图像(子图(c)和(f))示出S100(子图 (c))和波形蛋白(子图(f))与hPAP+GDAs共存。比例尺25μm。

图11示出GRP移植没有减少宿主星形细胞胶质化。在接受了GRP 移植的动物中，损伤后第8天的背柱病灶尾侧缘(LM)的共聚焦图像。 hPAP+GRPs填满损伤位点并迁移入邻近宿主白质，然而，宿主星形胶 质细胞显示与在对照未处理的病灶中观察到相类似的、偏离的 (misaligned)、增生性GFAP+突起。比例尺50μm。

图12示出在对照病灶中偏离的宿主星形细胞突起。子图(a)和(c)～ (f)是来自3组对照动物的尾侧病灶缘在损伤后第8天的共聚焦图像， 示出宿主星形胶质细胞肥大GFAP+突起的致密网络，这是形成胶质瘢痕 组织的特点。子图(b)是子图(a)框内的高倍放大图像。在病灶缘内 随机选择GFAP+突起并且使用Image Pro Plus软件在其上示踪“最适” 线。然后，邻近的GFAP+突起同样地被示踪且由Image Pro软件计算配 对的线间的角度。宿主GFAP+星形胶质细胞突起的定量分析揭示邻近的 配对突起之间的平均角度是59.4°(s.d.+/-22，中值＝61°)。比例尺(a， c-f)100μm。

图13示出宿主星形胶质细胞的线性化。子图(a)和(c)～(f) 是共聚焦图像，示出损伤后第8天3个接受了GDA移植的动物中尾侧 病灶缘中宿主GFAP+突起的引人注目的排列。子图(b)是子图(a)框 内区域的高倍放大图像。植入GDA的损伤位点边缘内的邻近宿主 GFAP+突起之间记录的平均角度仅仅11.6°(s.d.+/-12.6，中值＝7°)。 比例尺(a，c-f)100μm。

图14示出GDAs遏制切掉轴突的红核神经元萎缩。子图(a)是明 场像，示出损伤5周时对照、病灶+环孢菌素大鼠未损伤的右半球中甲 苯酚紫染色的红核神经元。子图(b)示出在损伤的左半球红核的神经 元萎缩波及48％甲苯酚紫染色的神经元。子图(a)和(b)的图像获得 自同一25μm冠状组织切片内的右核及左核。子图(c)示出GDA移植 挽救损伤的左半球红核中65％的神经元。子图(c)的图像获得自与(a) 和(b)中显示的图像相同的红核嘴侧-尾侧区域。比例尺100μm。

图15是图像，示出Grid Walk运动表现。相比于未处理的对照大鼠， 接受了2-型GDAs移植的大鼠示出在损伤后的所有时间点运动功能没有 复原。相反，接受了1-型GDA移植体的大鼠在所有时间点表现得比对 照明显更好并且其行为在损伤后3～28天明显改善(Two Way Repeated Measures ANOVA，p＜0.05)。

发明具体说明

本文提供了组合物和方法，用于治疗脊髓损伤或CNS的其它外伤 或退行性症状、促进轴突再生、遏制星形细胞胶质化、重新排列宿主组 织以及延缓轴突生长抑制性蛋白多糖表达。因此，提供了治疗受试者 CNS病灶的方法，包括给予病灶包含胶质限制性前体衍生的星形胶质细 胞或GDA的组合物。该方法可以用于治疗脊髓损伤或其它CNS病灶。 该方法也可以用于CNS病灶，其中需要促进宿主组织再生和/或重新排 列、调节CNS结疤应答以及保护神经元免于萎缩和死亡，或其任意组 合。

用在本文时，术语GDAs指胶质纤维酸性蛋白(GFAP)+/A2B5-细 胞，其在此也称为1-型GDAs，除非明确指2-型GDAs(GFAP+/A2B5+ 细胞)。

迄今，干细胞和神经前体细胞移植的有限成功可能由于成年CNS 损伤的炎性环境，其指引未分化的神经干细胞或胶质前体成瘢疤星形胶 质细胞样表型(Alonso，et al.，Glia 49：318-38 2005；Frisen，et al.，J.Cell Biol.131：453-64(1995)。瘢疤星形胶质细胞不能很好地支持轴突生长 (Groves，et al.，Dev.Biol.159：87-104 1993；McKeon，et al.，J.Neurosci. 11：3398-411 1991)。

本文描述的方法和组合物提供了替代方案以允许病灶环境指引干 细胞或前体细胞分化而仍旧保留以未分化的细胞开始的益处。本文提供 了治疗受试者CNS病灶的方法，包括给予病灶包含胶质限制性前体衍 生的星形胶质细胞(GDAs)的组合物。术语病灶用于本文指CNS损伤 的位点、CNS疾病发展、退行性损害或结疤的位点，在该位点促进再生 将提供益处。所提供方法的重要方面在于，在给予损伤位点之前GDAs 是由祖先前体细胞(例如GRPs)使用骨形态发生蛋白(BMP)家族成 员(例如，BMP-4)预分化的。GDAs也可以由其它祖先前体细胞预分 化，包括但不限于限制性星形胶质细胞前体细胞或神经上皮干细胞。使 用本领域已知的方法，GRPs可以来自全能(pluripotential)干细胞，例 如间充质干细胞和ES细胞(Mujtaba，et al.，Dev.Biol.214：113-27 1999) 以及神经上皮细胞(Rao and Mayer-Proschel Dev.Biol.188：48-63 1997)。

胶质限制性前体(GRP)细胞(Gregori，et al.，J.Neurosci.22：248-56 2002；Rao，et al.，Dev.Biol.188：48-63 1997；Rao，et al.，PNAS 95：3996-40011998)是最早产生的限于神经胶质再生的前体细胞群。区 别于胚-神经细胞黏附(E-NCAM)阳性神经元限制性前体，GRP细胞来 自多能(multipotent)神经上皮细胞，并且代表最早在CNS中表征的胶 质前体细胞之一。基于细胞表面标志物A2B5从发育的脊髓以及从成年 神经组织中分离了三能(tripotential)GRP细胞(Johansson，et al.，Cell 96：25-34 1999；Horner，et al.，J.Neurosci.20：2218-28 2000；Yamamoto，et al.，Exp.Neurol.172：115-272001)。

克隆分析证明当这些细胞在体外暴露于适宜的信号时能产生少突 胶质细胞以及两种不同类型的星形胶质细胞(1-型和2-型)。GRP细胞 在体内限于胶质谱系，由于它们在体内神经原性环境下不能产生神经元 表型。GRP细胞在新生和成年脑中存活并迁移。移植的GRP细胞在缺 少髓鞘的背景下分化成形成髓鞘的少突胶质细胞并且也在正常新生脑 中产生未成熟的少突胶质细胞。

任何细胞培养技术可以被用于制备GDAs。作为实例，可使用本领 域标准方法(例如流式细胞术或免疫淘选)从胚胎放射状胶质细胞或成 年脑室下区细胞的解离的细胞悬液分离A2B5+GRPs。GRP细胞也可以 使用利于选择这些细胞的生长方法分离。使用本领域已知的方法，GRPs 细胞也可以来自全能干细胞(例如间充质干细胞，ES细胞)和神经上 皮细胞，或者其它能够产生CNS神经胶质的干细胞。

GRPs可以在适合的培养基中于培养物中维持。例如，GRPs可以维 持于在混合的层粘连蛋白/纤维连接蛋白基质上具有约0.1～100ng/ml bFGF和SATO补充的培养物中。为了分化GRPs至GDAs，GRPs可以 被暴露于例如约1～100ng/ml重组BMP-4(例如在培养物中约7天)以 分化它们为GDAs。还公开了使用BMP家族其它成员，或者其它在1- 型星形胶质细胞的抗原性范围内沿星形胶质细胞途径诱导分化的信号 分子，只要该细胞进一步表达如本文所述的GDAs所表达的有益特性。

用于本文所述方法的GDAs可以利用下述方法产生，其包括从受试 者分离脑室下区细胞、纯化A2B5阳性GRPs、以及用BMP培养所述细 胞。GDAs也可以利用下述方法获得，其包括使全能或多能细胞接触诱 导分化的分子、从该细胞纯化A2B5阳性GRPs、以及用BMP培养所述 细胞。

为了保证用于移植的GDA悬液不含有未分化的GRPs或具有2-型 星形胶质细胞表型的细胞，污染的细胞类型可以从悬液中利用诸如用 A2B5抗体的免疫淘选而除去。小量获得的悬液可以覆在盖玻片上并用 A2B5和GFAP抗体标记以验证均一的1-型星形胶质细胞表型。对于移 植，GFAP阳性/A2B5阴性GDAs可以密度10³～10⁶细胞/μl悬浮于诸如 Hanks Balanced Salt Solution的适合的培养基中。

本文提供了分离的细胞群，包括至少约80％、85％、90％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％的纯的GDAs群或80～100％间的任何 百分数。如本文所使用，术语分离的指从其天然环境中被分离的细胞或 细胞群，例如，从供体动物(例如人)中取出。分离的细胞或细胞群可 以是组织样品的形式，例如完整的细胞片层(例如单层细胞)，或者其 可以在细胞悬液中。术语分离的不排除使用这些细胞的组合或与其它细 胞的混合物。术语群意图包括两个或多个细胞。群中的细胞可以从相同 或不同来源获得。因此，例如分离的细胞群可以包括至少90％的GDAs。 因此，分离的细胞群可以包括至少95％的GDAs或至少99％的GDAs。 在某些实施方式中，分离的细胞群不包括2-型星形胶质细胞或GRPs。 任选地，分离的细胞群不包括全能或多能干细胞，例如ES细胞或神经 上皮干细胞。然而，本文所提供方法中的分离的细胞群可以包括至多约 0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、 9％或10％的2-型GDAs、全能干细胞、多能干细胞、未分化的胶质前体 (例如GRPs)，或其任何组合。因此，例如，分离的细胞群可以包括 少于10％的2-型GDAs。因此，分离的细胞群可以包括少于5％的2-型 GDAs。细胞群的纯度可以利用诸如检测对培养物中不同细胞类型特异 标志物和通过视觉观察确定群中细胞类型的百分数，以及利用本文所述 或本领域已知的其它方法来测定。本文还提供了包括分离的细胞群的组 合物。

GRPs(由其衍生用于本文的GDAs)不被其来源限制。因此，可以 使用自体、异体或异种GRPs。自体前体细胞可以收集自患者自身的脑 室下区。异体细胞可以收集自败育胚或器官供体。异种细胞可以收集自 猪、猴或任何其它适合的哺乳动物。由于CNS是免疫特惠区 (immunologically privileged site)，当给予小量免疫抑制药物时，移植 的异种细胞可以存活。除了源自脑室下区细胞，GRPs可以源自神经上 皮干细胞、胚胎干细胞或其它能够产生CNS神经胶质的干细胞。

通过BMP暴露产生的GRP衍生星形胶质细胞(GDAs)落入由其 作为1-型星形胶质细胞的抗原性表型定义的细胞群内。对从出生后CNS 中纯化的细胞的体外研究显示，出生后来源的1-型星形胶质细胞在体外 促进神经突从多种神经元广泛生长(Baehr，Glia 3：293-300 1990；Noble， et al.，J.Neurosci.4：1892-1903 1984)、表达高水平的轴突生长支持性分 子，例如层粘连蛋白/纤维连接蛋白(Gallo，et al.，Exp.Cell Res. 187：211-23 1990)以及NGF/NT-3(Condorelli，et al.，J.Mol.Neurosci. 6：237-48 1995)并且还在体外显示出硫酸软骨素蛋白多糖最小的免疫反 应性。然而，尽管未成熟的皮质星形胶质细胞移植入成年脑损伤 (Wunderlich，et al.，Glia 10：49-58 1994)或急性成年脊髓损伤(Wang，et al.，Neurosci.65：973-811995)已显示出遏制星形细胞胶质化，但只观察 到了有限的内源性轴突出芽，而轴突没能穿透移植物中心或者超出损伤 位点再进入白质。

因此，尽管GDAs显示像1-型星形胶质细胞的抗原性表型，但GDAs 是独特细胞类型，当被移植入CNS病灶位点时促进前所未有水平的组 织重整、轴突再生和运动复原的。

GDAs在移植入CNS病灶位点后促进可靠的轴突再生和功能复原。 GDAs填充损伤位点、遏制星形细胞胶质化、重新排列宿主组织以及延 缓轴突生长抑制性蛋白多糖表达的能力表明这些细胞具有有效地提供 轴突再生环境的能力。结合其明显地降低切掉轴突的CNS神经元萎缩 以及支持可靠的行为复原的能力，这些性质使得GDAs成为修复损害的 或患病的CNS的高效细胞类型。因此，所提供方法中的GDAs可以促进 轴突再生、遏制星形细胞胶质化、重新排列宿主组织、延缓轴突生长抑 制性蛋白多糖表达，或其任意组合。

迄今，包括纯化的1-型星形胶质细胞在内，没有其它植入的细胞群 具有GDAs的多种且显著的有益作用。否则GDAs实现的轴突再生水平 只有在广泛的额外操作下才能实现。例如，挽救红核的神经元只在添加 脑源性神经营养因子(BDNF)时才实现。在这方面，这揭示GDAs和 之前研究的1-型星形胶质细胞的另一差别，因为之前的研究表明型星胶 质细胞不产生BDNF，而本文公开了GDAs中轻易检测的BDNF mRNA 水平。另外，包括GRP细胞自身在内没有其它移植产生由GDA移植所 实现的有益的组织重整。

使用本领域标准方法给予本文公开的GDAs以用于促进CNS神经 再生和/或瘢疤减少。

GDAs被用于治疗需要促进CNS再生和/或减少瘢疤形成的受试者。 因此，GDAs可以任何常规制剂施用于病灶区域。

病灶位置没有限制。因此，脑或脊髓的任何部位可被治疗。例如脑 皮质、中脑、丘脑、下丘脑、纹状体、黑质、桥脑、小脑、延脑或任何 颈、胸、腰、或骶髓段。该方法可用于任何神经系统病灶，包括例如脊 髓损伤造成的那些(例如，导致呼吸麻痹、四肢麻痹和下身麻痹)。

GDAs也可以给予神经系统已因外伤、手术、缺血、感染、代谢疾 病、营养缺乏、恶性肿瘤、毒剂、副肿瘤综合症和神经系统退行性病症 所损害或损伤的患者。这些病症的实例包括但不限于阿尔茨海默氏症、 帕金森氏症、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化症、进行性核上眼神经 麻痹症以及神经元病灶。GDAs可施用于创伤以减少瘢疤形成。因此， 手术后可施用GDAs以便减少来自因诸如动-静脉畸形、坏死、出血以及 开颅术引起的病灶的瘢疤形成(其可以导致继发性癫痫)。GDAs也可以 通过稳定癫痫灶并减少瘢疤形成用于治疗癫痫。

治疗可以在病灶发病后例如24h内或者例如1周、5年、甚至10年 以上进行。在可以预测病灶的情况下(例如手术)，GDA可以在发生前 或者期间递送。

GDAs可以通过直接施用而递送，例如，通过直接注射GDAs样品 入神经损害位点。例如脊髓可以利用椎板切除术暴露，以及使用微量注 射器在手术显微镜下注射细胞悬液。当获得高分辨率MRI图像，细胞 悬液可以在椎骨间注射而不进行椎板切除术(例如利用腰椎穿刺技术)。

任选地，GDAs在部分地妨碍其移动以便将GDAs定位到病灶位点 的介质中递送。作为实例，GDAs可以膏剂或凝胶递送，包括例如生物 可降解的凝胶类聚合物(例如纤维蛋白或水凝胶)。这种半固体介质具 有的优点在于其妨碍(瘢疤产生)不希望的间充质组分(例如成纤维细 胞)迁移入所述位点。

其它使用和施用GDAs的方法包括但不限于，使用聚合物移植物和 手术分流技术。这些方法可以一起、单独或与本文所述其它方法结合使 用。聚合物移植物和手术技术的应用是本领域技术人员公知的。例如， GDAs可以以播种(seeded)或包覆到聚合物移植物上的形式施用于病 灶位点。具有各种组成、孔径以及几何结构的各种类型的聚合物移植物 可用于本文。这些聚合物包括但不限于由硝酸纤维素、聚酸酐和丙烯酸 类聚合物所制造的那些(参见例如，在欧洲专利申请No.286284； Aebischer，et al.，1988，Brain Res.454：179-187；Aebischar，et al.，1988， Prog.Brain Res.78：599-603；Winn，et al.，1989，Exp.Neurol.105：244-250 中所述的那些，至少为了其中所述组合物而通过引用将这些文献并入本 文)。

聚合物可用作合成桥，在其上通过施用GDAs至桥末端或附近可以 促进神经再生并可以减少瘢疤形成。例如，在一个或多个末端，或者整 个管具有GDAs的丙烯酸类聚合物管可被用于在吻侧桥接(例如脊髓) 病灶部位或绕过病灶部位，在其上可诱导再生。可以例如在背柱或背传 入神经内使用半渗透管，该管可以含有并释放营养因子或抗炎剂。可被 使用的管的类型是本领域技术人员公知的。

本文公开的其它组合物(例如神经营养因子)的递送系统包括利用 附着到留置渗透泵的导管，通过遗传改造的生物递送系统(例如转导的 成纤维细胞或永生细胞系)的直接注射给药和通过直接注射基因或蛋白 到病灶位点处或其附近的脊髓实质而给药。

如果使用，非经肠道给予组合物通常具有注射特征。注射物可以常 规形式制备，或者作为液体溶液或悬液(适于注射前在液体中的悬浮溶 解的固体形式)，或者作为乳液。最近提出用于非经肠道给药的方法包 括使用慢释或缓释体系以便保持恒定剂量。参见，例如美国专利No. 3,610,795，其通过引用引入本文。

GDAs可以利用本领域已知的方法永生，以便保存星形胶质细胞或 GDAs的持续来源。永生的GDAs可以在体外无限地维持。本领域已知 的各种永生方法包括但不限于，病毒转化(例如使用SV40，多瘤病毒、 RNA或DNA肿瘤病毒，艾伯斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr Virus)，牛 乳头瘤病毒，或其基因产物)以及化学突变。细胞系可以利用复制缺陷 的病毒永生，或者仅仅利用表达转化病毒基因产物永生。例如GDAs可 以通过用于表达复制缺陷的转化病毒或其基因产物的重组表达载体转 化。这些方法是本领域已知的。

GDAs可以被低温贮藏。低温贮藏活细胞的各种方法是已知的且可 以被使用(参见例如，Mazur，1977，Cyrobiology 14：251-272；Livesey and Linner，1987，Nature 327：255；Linner，et al.，1986，J.Histochem.Cytochem. 34(9)：1123-1135；Senkan等的美国专利No.4,199,022；Schwartz的美 国专利No.3,753,357；Fahy的美国专利No.4,559,298，至少为了其中所 述的方法而通过引用将这些文献并入本文)。

一些试剂已被用于急性脊髓损伤(SCI)处理和CNS病灶，其可与 本文提供的组合物和方法组合使用。这些试剂包括减少水肿和/或炎性应 答的试剂。示例性试剂包括但不限于，甾体，例如甲基强的松龙；脂质 过氧化反应抑制剂，例如甲磺酸替拉扎特(lazaroid)；和抗氧化剂，例 如环孢菌素A、EPC-K1、褪黑素以及高剂量纳络酮。因此，本文提供 的组合物可以进一步包括甲基强的松龙、甲磺酸替拉扎特、环孢菌素A、 EPC-K1、褪黑素或高剂量纳络酮或其任意组合。

本文提供的组合物也可以包括谷氨酸受体拮抗剂，包括但不限于非 竞争性N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)离子通道阻断剂MK-801(地佐 环平，Merck&Co.，Inc.，Whitehouse Station，NJ)、1，2，3，4-四氢-6-氮-2，3- 二氧代苯并[f]喹喔啉-7-磺酰胺(NBQX)、加环利定(GK-11， Beaufour-Ipsen，Paris，France)和胍丁胺。

抗炎剂(例如CM101、细胞因子IL-10)和选择性环氧化酶(COX) -2抑制剂可以与本文描述的方法和组合物结合使用。因此，本文提供的 组合物可以进一步包括CM101、IL-10或选择性COX-2抑制剂或其任 意组合。

本文描述的组合物和方法也可以与凋亡抑制剂结合使用，例如半胱 天冬蛋白酶(caspase)抑制剂(例如Bcl-2)和钙依赖中性蛋白酶(calpain) 抑制剂。

本文描述的组合物和方法可包括内源性神经营养因子，包括但不限 于神经生长因子(NGF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、睫 状神经营养因子(CNTF)、神经营养因子-3和4/5(NT-3，NT-4/5)、 成纤维细胞生长因子(FGF)及脑源性神经营养因子(BDNF)或其任意 组合。

Netrins、semaphorins、ephrins、肌糖蛋白、整合素及硫酸软骨素蛋 白多糖(CSPG)的抑制剂可以用于本文的组合物。例如硫酸软骨素裂 解酶可用于除去CSPG。因此，本文提供的组合物可以进一步包括 netrins、semaphorins、ephrins、肌糖蛋白、整合素或CSPG的抑制剂。 因此，本文提供的组合物可以进一步包括硫酸软骨素裂解酶。

本文描述的组合物可包括IN-1抗体，其中和NoGo(髓鞘源性生长 抑制性蛋白)的抑制性蛋白活性，髓鞘相关糖蛋白(MAG)或其任意组 合。

可以使用通过直接细胞内机制在神经胞体起作用以促进神经突生 长的方法和试剂。因此可以在本文的组合物和方法中使用肌苷(一种嘌 呤核苷)和cAMP以及化合物AIT-082(一种合成的含有对氨基苯甲酸 部分的次黄嘌呤衍生物)(例如Neotrofin；NeoTherapeutics，Newport Beach，CA)。因此，本文提供的组合物可以进一步包括AIT-082。

基因治疗使得能改造细胞，这结合了细胞与基因递送系统的治疗优 点。例如，如果需要递送神经营养因子，形成髓鞘和分泌神经营养因子 的细胞可以被改造以促进神经突生长并修复神经功能。

来自患者自身血液的巨噬细胞(自体巨噬细胞)可以被活化并植入 脊髓损伤位点。患者自身活化的巨噬细胞可以清除退变髓鞘残余、富集 非容许性因子并因此促进再生生长而不引起免疫应答。

表现出再生生长或旁枝出芽的轴突纤维遇到抑制性环境以及需要 可容许性桥接物质的物理间隙。因此，合成桥可以用于本文描述的方法。 生物基质材料领域的进展提供了以人工材料(例如生物可降解的水凝 胶，或水凝胶与细胞的组合物)桥接该间隙的机会，其可促进再生。合 成桥需要的特性是同时提供轴突附着和生长的物理基质而不引发抗原 性宿主反应。

本文提供的方法和组合物可以进一步包括免疫抑制药物，例如环孢 菌素、他克莫司(FK505)、环磷酰胺(cyclophosamid)、硫唑嘌呤、甲 氨蝶呤、咪唑立宾(mizoribin)，单独或者以其任意组合或应用。可以 在注射GDAs之前或者与之同时或者以后给药。因此，本文提供的组合 物可以进一步包括环孢菌素、他克莫司(FK505)、环磷酰胺、硫唑嘌 呤、甲氨蝶呤或咪唑立宾。

本文描述的方法可以进一步包括作为单独步骤的在给予GDAs之 前、期间或之后给予试剂或化合物。本文描述的组合物和方法可包括任 意组合的前述试剂。作为实例，含有本文所述GDAs的组合物也可包括 谷氨酸受体拮抗剂和神经营养因子。一种或多种前述试剂可以与含GDA 组合物配制或者可与本文所述含GDA组合物分别给予。如果分别给予， 一种或多种额外试剂可以视情况在给予含GDA组合物之前，之后或同 时给予。

试剂、化合物或疗法的任何组合可以与本文所述的GDA组合物和 方法组合，即使没有明确地提及作为组合。例如，免疫抑制药物和GDAs 的组合可以进一步包括本文提及的任何其它试剂(例如，桥，神经营 养因子和/或抗炎剂)。

待注射的GDAs数量取决于物种、年龄、体重和病灶程度。通常， 对于成年患者，总量在约10³～10⁸的范围，包括10³～10⁵、10⁵～10⁸、 10⁴～10⁷细胞或在这些范围内的任何量。

本文提供的物质可以有效量或浓度递送。物质的有效浓度或量是导 致治疗或预防CNS病灶、促进轴突再生、遏制星形细胞胶质化、重新 排列宿主组织并延缓轴突生长抑制性蛋白多糖表达的浓度或量。术语治 疗上有效的指所用组合物的量是足够改善疾病或病症的一种或多种起 因或症状的量。该改善只需要减少或缓解，而不必是消除。

给予组合物的有效剂量和进度可以凭经验确定，且做出该决定是本 领域的技能。给予组合物的剂量范围是大到足以产生所需效果(其中影 响症状病症)。剂量不应过大以致于造成副作用(例如不希望的交叉反 应、过敏反应等等)。需要的组合物的确切量将在受试者间变化。通常， 剂量随患者年龄、症状、性别和疾病程度、给药途径，或者是否其它药 物包括在方案而变化，并且可以由本领域技术人员确定。如果发生禁忌， 可以由每位医生调节剂量。剂量可以变化，并且可以每日给药一剂或多 剂，持续一天或若干天。在文献中可以找到对于特定类药物产品的适宜 剂量的指导。

通过在培养基或药学可接受载体中制备培养的GDAs的细胞悬液， 提供的GDAs可以制备为用于施用。施用的细胞密度可以约10³～10⁶细 胞/μL。因此，本文提供了药学组合物，在药学可接受载体中包含有效 量的公开的GDAs。药学可接受载体指非生物学上或者其它方面不利的 物质，即该物质可与核酸或载体一起给予受试者而不造成任何不想要的 生物学效果或以有害的方式与含有其的药学组合物的任何其它组分相 互作用。术语载体指化合物、组合物、物质、或结构，当与化合物或组 合物组合时，其帮助或促成化合物或组合物用于其意图的用途或目的的 制备、储存、给予、递送、有效性、选择性或者任何其它特征。例如， 载体可以被选择以使活性成分的任何降解最小化并且使对本领域技术 人员公知的受试者的任何副作用最小化。该药学可接受载体包括灭菌的 生物相容性药学载体，包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。

试剂可以并入微粒、脂质体或细胞。任何包括GDAs的微粒、脂质 体或细胞可以通过抗体、受体或受体配体靶向特定细胞类型。靶向可以 通过本领域技术人员已知的各种方法完成，包括例如通过基因工程。

适合的载体和其制剂描述于Remington：The Science and Practice of Pharmacy(19th ed.)ed.A.R.Gennaro，Mack Publishing Company，Easton， PA 1995。典型地，适量药学可接受的盐被用在制剂中以致使制剂等渗。 药学可接受载体的实例包括但不限于盐水、Ringer′s溶液和葡萄糖溶液。 溶液的pH可以是约5～约8或者约7～约7.5。载体进一步包括缓释制 剂，例如固体疏水聚合物的半透基质，该基质是成形制品的形式，例如， 薄膜、脂质体或微粒。对本领域技术人员显而易见的是根据诸如给药途 径和给予组合物的浓度可更优选某些载体。

药学载体是本领域技术人员已知的。根据本领域技术人员使用的标 准方法，某些组合物可以这样给予，例如口服、肌内、皮下、静脉、脑 室内给予。

药学组合物可包括载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂和表面 活性剂。药学组合物还可包括一种或多种活性成分，例如抗菌剂、抗炎 剂和麻醉剂。

非经肠道给予的制剂包括无菌的水或非-水溶液，悬液和乳液。液体 载体包括水、醇/水溶液，乳液或悬液，包括盐水和缓冲介质。非经肠道 介载体包括氯化钠溶液、Ringer′s葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸Ringer′s 或不挥发油。静脉载体包括液体和营养补充液以及电解质补充液(例如 基于Ringer′s葡萄糖的那些)。也可存在防腐剂和其它添加剂，例如抗 菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。

本文公开了集合反应试剂(drawn to reagents)(可用于实践本文公 开的方法)的试剂盒。试剂盒可以包括将被理解为实践所公开的方法所 需的或有益的任何反应试剂或反应试剂组合。例如，试剂盒可包括本文 公开的GDAs或其前体，以及使用它们所需的缓冲液和酶。试剂盒的其 它实例包括本文所述的GDAs，以及神经营养因子(例如NGF)，以及 使用它们所需的缓冲液和酶。试剂盒最好包括GDAs和在本文所述方法 中使用它们的说明。

公开的方法和组合物可用于众多领域，包括但不限于治疗CNS病 灶。公开的组合物和方法也可以各种方式用作研究工具。其它用途被公 开，从公开内容显而易见，和/或将被本领域技术人员理解。

当用于说明书和所附的权利要求书时，除非上下文中另有明确说 明，否则单数形式的a，an以及the包括所指对象的复数。因此，例如， 提及药学载体包括两种或多种该载体的混合物。

公开了材料、组合物和组分，它们可被用于本发明公开的方法和组 合物的产品、可与其结合使用、可用于制备它们，或者为本发明所公开 方法和组合物的产品。这些和其它材料在本文公开，并且应理解的是， 当公开了这些材料的组合、子集、相互作用及群体时，对每个不同个体 及全体的组合及这些化合物的排列的具体参考可能没有明确地公开，但 每个都在本文具体地考虑并描述。例如，如果公开并讨论了细胞，并且 讨论了可以对包括该细胞在内的许多分子进行的许多改变，除非特别指 明为相反，细胞的每个组合和排列以及可能的改变被明确考虑。因此， 如果公开了一类分子A，B和C以及一类分子D，E和F以及公开了分 子组合A-D的实例，那么即便没有单独列举每个，每个都单独且全部地 被考虑。因此，在这个实例，组合A-E，A-F，B-D，B-E，B-F，C-D， C-E和C-F中的每个被具体的考虑并且应被理解为由A，B，和C；D， E和F；以及A-D的组合的实例的公开内容所公开。同样地，其任何子 集或组合也被明确考虑并公开。因此，例如A-E，B-F和C-E的亚组被 具体的考虑并且应被理解为由A，B和C；D，E和F；以及A-D的组合 的实例所公开。这一概念用于本申请所有方面，包括但不限于制造和使 用所公开组合物的方法中的步骤。因此，如果有大量可以进行的附加步 骤，应理解的是这些附加步骤中每个可以与公开的方法的任意具体要素 或要素组合一起进行，并且每种该组合是明确考虑的并且应被理解为已 公开。

范围在本文可以表达为从约一个特定值和/或到约又一个特定值。当 表达了该范围，其包括从一个特定值和/或到另一特定值的范围。进一步 理解的是，每个范围的端点都很重要，无论是与另一端点有关，还是与 另一端点无关。还应理解的是，本文公开了一些数值，并且每个值也作 为除了该值本身以外约该值在本文公开。例如，如果公开了数值10， 那么也公开了约10。也应理解的是也公开了在两个特定单元之间的每个 单元。例如，如果公开了10和15，那么也公开了11、12、13和14。

如全文所使用，受试者指个体。因此，受试者可以包括，例如家养 动物，例如猫和狗，家畜(例如牛、马、猪、绵羊和山羊)，实验动物(例 如小鼠、兔、大鼠和豚鼠)哺乳动物、非人哺乳动物、灵长类，非人灵 长类，啮齿类，鸟类，爬行类、两栖类、鱼类和任何其它动物。受试者可 以是哺乳动物，例如灵长类或人类。

如本文所使用，治疗(动)或治疗(名)不需彻底治愈。其也指潜 在疾病的一种或多种症状减少，和/或造成症状的一种或多种潜在的细 胞、生理或生物成因或机制减少。应理解的是在上下文中使用的减少指 相对于疾病状况，包括疾病的分子状况，而不仅仅是疾病的生理状况。

当术语预防(动)、预防(形)和预防(名)连同对特定症状的特 定治疗用于本文(例如预防CNS病灶)，它们指被治疗的受试者或者 根本没有发展成症状的可观察到的水平，或者与他/她缺乏该治疗相比发 展得更加缓慢和/或发展成较低程度。这些术语不是仅限于受试者没有经 历该症状的任何方面的情况。例如，如果在暴露受试者于刺激源(其被 预测将产生该症状的特定表现)时加以处理，导致受试者经历比其它预 期更少和/或更轻的症状病征，该处理可以被说成预防了症状。处理可以 预防CNS病灶，例如，通过导致受试者仅显示轻度外显的病灶病症。

贯穿本申请文件的说明书和权利要求，词语包括(comprise)及其 变形(例如包括(comprising)和包括(comprises))指包括但不限于， 并且不意图排除例如其它添加物、组分、整数或步骤。

任选的或任选地指随后描述的事件或情况可以或可以不发生，并且 指本说明书包括所述事件或情况发生的情况及不发生的情况。

整个申请中，参考了各种出版物。这些出版物的公开内容在此作为 整体通过引用引入本申请，以便更全面地说明与此有关的最新现有技 术。为了在依赖于参考文献的文句中讨论的包含在这些文献中的材料， 公开的参考文献也被单独地且具体地引入本文。

应理解的是公开的方法和组合物并不限于特定的方法学、原理，并 且按此描述的反应试剂可变化。还应理解的是本文使用的术语仅是为了 说明具体实施方式的目的，而并不意图限制本发明的范围，该范围仅由 附加的权利要求所限定。

除非另有定义，本文使用的所有技术和学术术语具有与公开的方法 和组合物所属领域技术人员通常理解相同的含义。并非承认任何参考文 献都构成现有技术。对参考的讨论陈述了其作者的主张，并且申请人保 留质疑所引用文献的准确性和相关性的权利。应清楚地理解，尽管本文 参考了一些公开出版物，但是这些出版物不构成承认任意这些文献形成 本领域公知常识的一部分。

实施例

实施例1.GDA移植促进轴突再生

方法

GRPs分离和GDAs生成

通过荧光活化细胞分选(FACS)从来自E13.5转基因Fischer 344 大鼠胚胎的脊髓的解离细胞(dissociated cell)悬液分离A2B5+GRPs， 其在ROSA26启动子(TgN(R26ALPP)14EPS)(Kisseberth，et al.，Dev. Biol.214：128-381999)的控制下表达人胎盘碱性磷酸酶基因。在混合的 层粘连蛋白/纤维连接蛋白基质上以DMEM-F12培养基(Invitrogen，Inc.， Carlsbad，CA)(补加有10ng/ml bFGF(Sigma，St.Louis，MO)和SATO) 在培养物中维持GRPs并且暴露于10ng/ml人重组BMP-4(R&D Systems， Minneapolis，MN)培养7天以分化它们为1-型星形胶质细胞。

GDA表型的体外表征

培养物中的细胞用抗A2B5或抗-NG2抗体(Chemicon，Temecula， CA)进行活细胞标记，然后用冷的酸/醇固定并且用抗-GFAP(Sigma，St. Louis，MO)、抗-FGFR3(Sigma，St.Louis，MO)或者抗-plp/DM20 (Chemicon，Temecula，CA)抗体标记。二抗购自Jackson Immunologicals (West Grove，PA)和Molecular Probes(Eugene，OR)。BMP-诱导的 GDAs在体外对人碱性磷酸酶有均一的免疫活性。当没有在这些培养物 中检测到NG2+或蛋白脂蛋白/DM20+少突胶质前体时，BMP-4处理后 偶尔检测到未分化的GRPs(A2B5+/GFAP-)或2-型星形胶质细胞 (A2B5+/GFAP+)。这些细胞类型代表少于1％的总细胞群。为了保证 用于移植的GDA悬液不含有未分化的GRPs或者具有2-型星形胶质细 胞表型的细胞，可能污染的细胞类型利用A2B5抗体的免疫淘选从悬液 除去。小量的获得的悬液覆在盖玻片上并用A2B5和GFAP抗体标记以 检验均一的1-型星形胶质细胞表型。对于移植，100％GFAP阳性/A2B5 阴性的GDAs以密度30,000细胞/μl悬浮于Hanks Balanced Salt Solution。

病灶模型和细胞移植

成年雌性Sprague Dawley或Fischer 344大鼠(3月龄，Harlan， Indianapolis，IN)通过注射含有氯胺酮(42.8mg/ml)、甲苯噻嗪(8.2 mg/ml)和乙酰丙嗪(0.7mg/ml)的混合剂(cocktail)麻醉。对于背柱 损伤(图1A和1B)，右侧背柱在颈椎1和2之间使用30号针作为刀 刃单侧横切。病灶延伸至1mm深度和从中线向两侧延伸1mm。对于红 核脊髓束病灶，对包括红核脊髓途径在内的右侧背外侧索的单侧横切在 C3/C4脊髓水平使用Fine Science Tools微型手术剪进行。病灶延伸至 1mm深度和从脊髓外侧软膜表面向内侧延伸1mm(图1C)。

每只动物总计4μl的GDA或GRP悬液(30,000细胞/μl；120,000细 胞)急性移植入背柱病灶上6处不同位点，即分别在病灶缘嘴侧和尾侧 的内侧和外侧注射一次，和两次注射到病灶中心内侧和外侧区域(图 1A)。所有背柱体内实验在没有免疫抑制剂下进行。GDA移植体以相 同模式注射到背外侧索病灶并且每个损伤位点处注射总计6μl GDA悬 液(30,000细胞/μl；180,000细胞)。对照损伤鼠注射6μl的Hanks Balanced Salt Solution。对于背外侧索组的许多大鼠的实验终点是损伤后/移植5 周，所有大鼠从移植前一天开始贯穿实验的过程接受每日注射环孢菌素 (1mg/100g体重)。脊髓被暴露但并未产生病灶的假手术大鼠，以及受 到病灶但没有环孢菌素的大鼠被包括作为对照组。

脊髓损伤后的瘢痕形成以及CSPG表达在成年Sprague Dawley大鼠 (CNS再生研究中常用的品系)中表征。单侧背柱穿刺损伤，可靠地产 生大小均一的病灶并诱导成年雌性Sprague Dawley大鼠中CSPG表达的 一致的、可量化的改变。然而，由于GDAs来自hPAP Fischer 344大鼠， 初始试验系列对成年雌性Fischer 344和Sprague Dawley大鼠的背柱损伤 的病灶内GDA移植进行(对比未处理的对照)以及检测轴突生长从邻 近背跟神经节(DRG)神经元移植穿过损伤位点的能力(对比没有接受 GDAs的对照)。尽管GFP+轴突始终不能穿过两种大鼠品系的对照病灶， 在对照Fischer 344大鼠观察到病灶大小以及边缘形态学的显著变化，该 现象在Sprague Dawley大鼠中没有观察到。Fischer 344大鼠中的病灶大 小以及病灶缘距病灶中心的嘴侧-尾侧距离的更大变化阻止在这一大鼠 品系中对距病灶中心固定距离的内源性、BDA标记的轴突生长数量的精 确定量。因此，对比对照背柱病灶动物，在Sprague Dawley大鼠中进行 单独研究以调查和量化植入GDA的动物中BDA+内源性感觉轴突再生 和CSPG表达。用于每个研究的大鼠品系和动物数参见表1。因此，在 两种不同大鼠品系，在两项单独的轴突再生实验中，以GDAs桥接背柱 病灶全部导致健壮的轴突生长穿过损伤位点且轴突没能穿过对照损伤。

表1、每个实验组的动物数

实验1：分析内源性感觉轴突再生、CSPG表达、以及GDA表型

实验2：分析来自植入GFP+的感觉神经元的轴突生长

实验3：分析红核脊髓束(RST)轴突生长、红核、以及行为复原；Cyc， 环孢菌素。

成年DRG神经元移植

从表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因的10～12-周龄转基因鼠 制备成年鼠感觉神经元的单细胞悬液。不向神经元悬液添加生长因子。 500nl神经元悬液(～1,500神经元/μl)急性微移植入病灶尾侧约500μm 的背柱白质(图1B)。

组织学

在手术后4天、8天和5周，深度麻醉动物并心脏(transcardially) 灌注0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)，随后是0.1M PBS中4％多聚甲醛。 对于冷冻切片，切开的脊髓在30％蔗糖/PBS溶液于4℃冻存过夜。组织 包埋于OCT(最佳切片温度)化合物(Sakura Finetek USA，Inc.，Torrance， CA)并快速冷冻。连续地在矢状平面切下厚25μm的冷冻切片并且风干 到涂有明胶的载玻片。对于Vibratome切片法，切下的脊髓在4％多聚 甲醛中后固定过夜，然后包埋于5％明胶/5％琼脂。厚75μm的连续的矢 状切片被收集并按照自由漂浮切片加工。所有组织切片在PBS中冲洗， 用溶液中带有0.1％Triton/PBS的4％正常山羊血清封闭30min，然后在 封闭溶液中使用适宜的一抗于4℃孵育过夜。室温下孵育二抗1h。

使用下述一抗：单克隆抗-GFAP(Sigma，St.Louis，MO)和多克隆 抗-GFAP(Sigma，St.Louis，MO)；单克隆抗-波形蛋白(Chemicon， Temecula，CA)；多克隆抗-S100(Dako，Carpinteria，CA)；1F6抗-神 经蛋白聚糖(Developmental Studies Hybridoma Bank，Iowa City，IA)； 多克隆抗-NG2(Chemicon，Temecula，CA)；多克隆抗-GFP(Molecular Probes，Eugene，OR)；单克隆抗-hPAP(Sigma，St.Louis，MO)；多克 隆抗-hPAP(Fitzgerald，Concord，NH)；CS56，软骨素6和4硫酸蛋白 多糖(Sigma，St.Louis，MO)。Cy5，Cy2(Jackson Immunologicals，West Grove，PA)，Alexa-488和Alexa-594(Molecular Probes，Eugene，OR) 偶联的二抗用于显现一抗的结合。所有二抗相对鼠血清被预吸附。为了 控制非特异性二抗结合，邻近的切片也按上述加工，但不用一抗。标记 的切片使用Olympus BX60荧光光学显微镜和Leica TCS SP2共聚焦显 微镜检查。分子共存和细胞联合用Leica 3D分析软件确定。用共聚焦显 微术(Leica TCS SP2)获得矢状平面的截面切片的所有免疫组化图像。 病灶嘴侧脊髓在所有图像中显示在左侧。

内源性感觉或红核脊髓轴突示踪

在两个病灶模型中，内源性轴突通过在实验终点8天前注射无菌 PBS中10％生物素化葡聚糖胺(BDA)被示踪。在背柱病灶模型，通 过在C3/C4脊髓水平将BDA注射入右侧、楔束和薄束白质至深0.5mm 示踪了上行内源性轴突(图1B)。在背外侧索病灶模型中通过注射BDA 到左半球红核大细胞区示踪了下行红核脊髓束轴突。对于BDA标记的 轴突的组化分析，25μm连续的矢状切片被收集并加工用于如上所述的 免疫组化。BDA通过与VectastainABC溶液(Vector Labs，Burlingame， CA)孵育组织切片而显现，并且进一步用Tyramide-Alexa 488试剂 (Molecular Probes，Eugene，OR)增强。

内源性感觉轴突的量化

BDA标记的轴突数量在横跨背柱损伤位点内侧-外侧范围的每三 个组织切片的下述位置计算：损伤位点尾侧0.5mm；直接在损伤中心； 损伤位点嘴侧0.5mm，1.5mm和5mm；以及在背柱核之内。为了控制 动物之间轴突示踪/标记效率的不同，对检查的每张组织切片，在病灶中 心内以及所有嘴侧位点处计算的BDA标记的轴突数量归一到病灶位点 尾侧0.5mm检测的BDA标记的轴突数量。来自每种单独的动物(对照 和植入GDA的)的每张组织切片的标准值被平均化以产生每种动物的 数值。每种动物的值(n＝6植入GDA的，5对照)然后平均化并图像 显示。视情况进行ANOVA或t-检测，p＜0.01。对于分析从微移植的感 觉神经元的GFP+轴突生长的分别实验，使用相同的方法计算来自备用 的矢向的75μm vibratome切片的GFP+轴突。

宿主GFAP+星形胶质细胞突起排列的量化.

通过扫描30μm厚的GFAP免疫染色的尾侧和腹侧背柱病灶缘矢向 切片产生共聚焦图像以显示宿主星形胶质细胞突起。在3组对照和3组 植入GDA的大鼠中从病灶外侧到内侧中心选择5张切片(见图10和 11)。在每个共聚焦图像内，GFAP+突起在病灶缘内随机选择并使用 Image Pro Plus软件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)在其上示踪 “最适”曲线。然后，直接邻近的GFAP+突起同样地被示踪且线间角度由 Image Pro软件计算。总计来自每个共聚焦图像的20对GFAP阳性宿主 星形胶质细胞突起(每组5个图像)被分析并且测定平均角和中位角 (median angle)。进行t-检验以测定在GDA和对照组的星形胶质细胞 突起间所测量角度差别的统计学显著性(p＜0.0001)。

Grid Walk行为分析

手术前两周，训练大鼠走过水平梯(Foot Misplacement Apparatus， Columbus Instruments，Columbus，OH)且只有始终通过而没有停下的大 鼠被选择用于研究。Grid Walk试验是对大鼠有节奏地举步以及协调准 确的放置前肢和后肢能力的灵敏的测量。训练的大鼠随机分配为4组： 红核脊髓束(RST)损伤+GDA+环孢菌素(n＝9)；RST病灶+悬浮液 介质+环孢菌素(n＝9)；仅仅RST病灶(n＝7)；假手术(n＝7)。 手术前一天(基线)以及在术后第3、7、10、14、17、21、24和28 天的时间点，每只大鼠试验3次并且每次试验的错步数平均化以产生每 种动物的每日得分。Two Way Repeated Measures ANOVA和Tukey Post Test(p＜0.05)用于分析数据。

红核神经元的量化

损伤/移植后5周，来自经历了行为分析的大鼠脑的25μm连续的 冷冻切片在冠状面切下。通过红核嘴侧-尾侧范围的每三张切片用0.2％ 甲苯酚紫染色。标准的、基于设计的体视学方法(CAST软件，Olympus America Inc.，Mellville，NY)用于量化植入GDA的(n＝6)和对照(注 射介质(media)的/环孢霉素，n＝6))大鼠在RST病灶的每个半球的红核 神经元数量。光学分离器(optical fractionator)被用于每6张切片的红 核左右半球。直径大于20μm且具有特有的神经元形态学的胞体被计数。 对每种动物，在左半球损伤的红核计算的神经元数归一化为未损伤的右 半球核获得的计数。每种动物在一组内的数值被平均化且图像显示。进 行t-检验以测定组间差别的统计学显著性(p＜0.01)。

结果

内源性感觉轴突的再生

在大鼠背柱白质穿刺损伤病灶移植GRP源性星形胶质细胞(GDAs) (图1A)导致大部分轴突横切的感觉轴突长入病灶中心(图2及图3 的子图(a))，这些轴突的66％进一步延伸超出病灶位点入邻近的白 质(图2以及图3的子图(a)，(b)，(d)，(e)和(f))。为 了标记其余轴突最少，用单独的生物素化葡聚糖胺(BDA)注射GDA- 移植的或对照穿刺损伤尾侧的右侧背柱楔束和薄束白质途径，示踪与病 灶位点对齐的、预计(discreet)的上行感觉轴突群通路(图1B)。在 损伤后8天从每三张旁矢状切片的样品计数揭示对照和实验的脊髓中损 伤位点尾侧0.5mm的BDA标记的轴突数量相似(分别地，107+/-47与 101+/-45)。在植入GDA的脊髓，平均61％(s.d+/-11)尾侧标记的 轴突延伸入病灶中心，39％(s.d.+/-15)尾侧轴突延伸超出病灶中心 0.5mm进入邻近白质，28％(s.d.+/-7)延伸超出病灶位点1.5mm。甚至 在相对短的第8天时间点，小量轴突仍进一步延伸，在植入GDA的动 物，平均7BDA+轴突(s.d.+/-5；即7％)在每只动物损伤位点嘴侧5mm 以及4个轴突(s.d.+/-3；即4％)在背柱核被检测到。相反，在4/5对 照动物，病灶中心内或者超出损伤的白质内没有观察到轴突。仅在1/5 对照动物，6BDA+轴突(4％)发现在病灶位点的腹侧大部分区域(即 在腹侧缘)，有效地接近尾侧病灶缘并因此与病灶中心排成一线。这些 最可能因为该动物中有限的轴突保留(sparing)/出芽，导致在楔型途径 腹侧白质的这些轴突出现在与灰质的界面处。在该动物中，没有观察到 BDA+轴突超出病灶嘴侧1.5mm(图2)或者观察到跨近软膜表面损伤 位点或在所有对照动物特有的病灶中心的GFAP阴性区域内，这证明了 这6个轴突在灰/白质界面损伤周围出芽而不是保留。总的来说，在对照 脊髓中约99％的BDA+轴突断端保留在尾侧病灶缘内并显示出营养不良 的末梢(图3的子图(c))。鲜明的对比，在GDA移植体与邻近白质 的尾侧界面相比于对照损伤位点，观察到非常少的营养不良轴突(对比 图3的子图(c)和(d))。

轴突生长支持性GDA桥

尽管在植入GDA的脊髓病灶中心内以及嘴侧病灶缘内所有点中内 源性感觉轴突的存在表明真实的再生而不是保留，在成年DRG神经元 /GDA移植体模型中检测到GDAs支持成年感觉轴突跨相同穿刺损伤生 长的能力。这些实验中，不同系列的大鼠接受了成年鼠GFP+感觉神经 元微移植，其急性注射到在尾侧离GDA-移植的(图1B以及图4的子 图(a))、GRP移植的(图1B以及图4a子图(a))或者对照介质 注射的穿刺损伤400-500μm的背柱白质内。从移植的成年感觉神经元新 生长的轴突始终没能穿过试验的背柱穿刺病灶。相比于在损伤后/移植第 8天轴突完全没能穿过注射介质的或植入GRP的动物的病灶位点(图4 的子图(c))，53％(s.d.+/-3)的嘴侧方向的GFP+轴突长入病灶中心， 62％的在病灶中心的轴突达到超出GDA-填充的病灶中心0.5mm，42％ 达到进入嘴侧白质1.5mm，少量轴突延伸至超出损伤位点2mm(图4 的子图(a)和图9的子图(a))。从这些单独实验的数据对比揭示轴 突生长出填充GDA的损伤的效率显著相似(66％BDA+轴突，62％GFP +轴突)。

GDAs整合到病灶脊髓的重要性由GDAs对病灶占据程度与轴突生 长范围之间的显著相关性指示。在GDAs没有完全填满病灶位点的2只 植入GDA的动物中，非常少的GFP+轴突穿透GDA-缺乏的尾侧病灶缘 且病灶中心内GFP+轴突被限制于含有GDAs的区域(图4的子图(b))。 在缺乏hPAP+GDAs的病灶区域，GFP+轴突在尾侧病灶缘内形成营养 不良的末梢(图4的子图(b))。这些情况中，没有观察到轴突跨损 伤位点并进入嘴侧白质。在两套轴突生长实验中，轴突在白质中或在 GDA-移植的病灶中心内很少成束状。GFP+轴突生长通常与hPAP+ GDAs突起排成一线(图9的子图(a))，且与宿主GFAP+星形胶质 细胞突起在病灶缘嘴侧和尾侧平行(图9的子图(b))。类似地，BDA+ 内源性轴突总是与病灶缘的嘴侧(图3的子图(b))和尾侧(图3的 子图(d))内hPAP+GDAs排成一线。

宿主组织线性化

在两个感觉轴突再生实验中，观察到轴突生长明显线性化，尤其是 病灶缘内(图3的子图(a)和(d)以及图9的子图(a)～(c))， 其促进检测潜在的组织结构体。相比于未处理的对照，GDA移植与星形 胶质细胞胶质化的主要减少相关，伴随着宿主星形细胞胞体和突起在病 灶缘内明显的重整(图5A的子图(a)～(d))。由于GDAs来自表 达人胎盘碱性磷酸酶(HPAP)的动物，这些细胞以用于各种细胞类型 特异性抗原的双标记联合检测。为了检测宿主星形胶质细胞，GFAP在 移植的GDAs中的下调(图5A的子图(b))被用于鉴定具有抗-GFAP 免疫染色的宿主星形胶质细胞。然而，病灶内的GDAs保留S100+和波 形蛋白+，(图10的子图(a)～(f))并且不表达少突胶质细胞谱系 抗原NG2(图6的子图(e)～(h))或蛋白脂蛋白。对照注射介质 的或植入GRP的脊髓病灶缘内的GFAP+宿主星形胶质细胞显出成年反 应性星形胶质细胞特有的增生性胞体并且形成众多的、分支的、突起偏 离的致密团块，这是星形胶质细胞瘢痕组织的特点(图3的子图(c)， 图5A的子图(a)～(c)以及图11的子图(a))。相比之下，在接 受了GDA移植体的动物中，在病灶缘内的宿主GFAP+星形胶质细胞突 如今朝向病灶中心(图5A的子图(b)～(c)以及图13)。在对照病 灶缘中宿主GFAP+星形胶质细胞突起的定量分析揭示邻近的星形胶质 细胞突起对之间的平均角度59.4°(s.d.+/-22，中位角＝61°)。然而， 填充GDA的病灶在病灶缘内的相邻宿主GFAP+突起之间具有平均角度 仅为11.6°(s.d.+/-12.6，中位角＝7°)(图5B)。病灶缘内的GDAs 通常与内源性GFAP+星形胶质细胞交织(图5b)，在GDA桥接病灶和 邻近白质之间产生排成一线的且潜在的更多许可轴突生长的过渡(图5A 的子图(d)以及图5B)。GDAs重新排列损伤的宿主脊髓白质的能力 可能在促进高效率轴突跨GDA桥接的损伤生长上起重要作用。

对抑制性蛋白多糖的遏制

允许轴突生长的星形胶质细胞部位的产生也与背柱病灶中的轴突 生长抑制性蛋白多糖的延迟表达相关，该星形胶质细胞部位在接受了 GDAs的大鼠中与正常脊髓瘢痕组织生理不相似。损伤后4天检测的对 照DC病灶缘显示出与大量、细的GFAP阴性突起相关的高密度的神经 蛋白聚糖(图6的子图(a))，其以前显示出主要与NG2+胶质细胞相 关(Tang，et al.，J.Neurosci.Res.71：427-44 2003)。另外，对照病灶中 强NG2免疫反应性主要与对照病灶中心的侵袭性脑膜成纤维细胞以及 血管相关(图6的子图(d)和(g))。相比之下，含有GDA移植物 的病灶缘在损伤后第4天显示出总体神经蛋白聚糖免疫反应性(图6的 子图(b))相比于对照(图6的子图(a))显著减少。神经蛋白聚糖 的这种表达模式与之前在损伤后第2天在对照病灶观察的(Tang，et al.， 2003)相似。植入GDA的损伤位点也显示出在损伤后第4天NG2免疫 反应性相比于对照大大降低(图6的子图(e)和(f))。然而在第8 天时间点，在GDA-移植的病灶缘中神经蛋白聚糖免疫反应性的强度及 分布与损伤后8天在对照损伤中检测的神经蛋白聚糖(图6的子图(c)) 相似，表明GDA移植体的作用是延迟病灶缘内神经蛋白聚糖的表达。 然而，值得注意地，病灶缘内以及中心的GDAs显示出很小的神经蛋白 聚糖免疫反应性或者没有(图6的子图(c))。不像第8天时对照脊 髓中病灶中心内NG2免疫反应性的更加均一的密度，植入GDA的损伤 内的NG2免疫染色具有更加不均匀的分布(图6的子图(h)和(i))。 这反映了NG2阴性GDA与宿主NG2阳性组织在病灶中心的嵌合混合 (对比图6的子图(g)，(h)和(i))，因为即使在移植后第8天也 没有在病灶检测到hPAP+/NG2+细胞。然而在损伤后第8天对植入GRP 的背柱损伤内CSPG沉积的分析揭示在病灶缘内和中心都对CS56(对6 和4硫化CSPGs的通用标记)以及神经蛋白聚糖和NG2有强的免疫反 应性。

红核脊髓轴突再生

损伤/GDA移植后第8天，6只大鼠中的4只显示出完全填满损伤位 点的GDA移植体。迁移的hPAP阳性GDAs的闪光斑延伸入损伤边缘(图 7的子图(a))，以与背柱损伤内观察到成功的GDA移植物类似的方 式整合并与GFAP+宿主星形胶质细胞突起排成一线。相比于对照病灶中 心内完全没有RST轴突(图7的子图(b))，BDA标记的RST轴突 群明显地存在于植入GDA的病灶中心内(图7的子图(a))以及超出 损伤位点多达1.5mm的尾侧白质内。然而，这些动物中多数切掉轴突的 RST轴突观察到与GDAs在嘴侧病灶缘相互作用并且只在病灶中心 300μm内出芽(图7的子图(a))。对照损伤位点中大部分BDA+轴 突显示营养不良末梢且距病灶中心500～800μm(图7的子图(b))。 在GDA桥接损伤中，那些长入尾侧白质的轴突总在损伤位点的腹侧部 分观察到，这与更经常连续横跨损伤位点的GDA移植体的区域相关(图 7的子图(a))。6只动物中剩下的2只的GDA移植没有横跨损伤位 点(也见图4的子图(b))，在超出损伤位点的白质内没有观察到BDA 轴突。在所有六只植入GDA的大鼠和六只单独注射介质的对照中，损 伤后第8天，在超出损伤位点的邻近脊髓灰质内没有观察到BDA标记。

在损伤后5周已经检测不到hPAP阳性GDAs，然而BDA+RST轴 突仍旧在病灶中心内被观察到并且在尾侧白质内进一步延伸超出损伤 位点多达3mm。特别地，在9只大鼠中有6只，如今也观察到RST轴 突在损伤中心的更背侧区域内出芽并且甚至长出到背根(图7的子图(c) 和(d))。损伤位点尾侧白质内，在轴突上观察到生长锥，这清楚地 表明成功的GDA移植体刺激了RST轴突再生超出损伤位点。在9只大 鼠中有2只，一些形态学上与轴突支配的末端区域所见类似的广泛分散 的、轴突分枝现在也在灰质超出损伤位点距离1～2mm处被检测到(图 7的子图(f))。尽管仍旧保留了比对照更多的嘴侧-尾侧排列，宿主 GFAP阳性星形胶质细胞突起在更背侧的病灶缘内比植入GDA的损伤 腹侧边缘显著地更肥大(图7的子图(c))。在接受损伤和环孢菌素 但没有GDA移植体的对照大鼠中，RST轴突在损伤后5周保留在嘴侧 病灶缘并显示营养不良的末梢。

GDA移植遏制红核神经元萎缩

RST横断后红核中的神经元在损伤后1周萎缩。基于设计的体视学 分析揭示在损伤/移植后5周，在植入GDA的大鼠损伤的红核中检测到 的大于20μm胞体直径的甲苯酚紫标记的神经元的数量相比于对照大鼠 明显增加29％。在植入GDA的大鼠中，损伤的左半球红核中的神经元 数量平均减少至未损伤的右半球核的神经元数量的81％，相比之下，在 对照大鼠中是52％(图8的子图(a))。

GDA移植促进行为复原

背外侧索的横断切断了下行的脊椎轴突，导致前肢和后肢大体和精 细运动功能的慢性缺陷，这可以被Grud Walk行为检验所检测，背外侧 索横断以后，受到GDA移植体的大鼠在手术后所有时间点比对照表现 明显更好(图8的子图(b))且其行为在损伤后3天～28天显著改善 (Two Way Repeated Measures ANOVA，p＜0.05)。受到GDA移植体的 大鼠在损伤/移植后3天产生平均4.7个错误并且在损伤后28天改善到 平均2.9个错误。相反，对照病灶大鼠在损伤后3天产生平均6个错误， 并且在任何后续时间点没有显示出统计学显著性增加，在损伤后28天 具有平均5.1个错误。手术之前，对照和处理组的大鼠表现的一样好， 具有基线平均2.0个错误。因此植入GDA的动物产生的平均错误数改善 至基线上惊人的0.9个百分点，表示相比于对照损伤的大鼠在损伤后28 天复原70％。在第28天对各个大鼠的显著性分析显示接受了GDA移植 体的9只病灶动物中4只与其手术前的分数数统计学上相同。

实施例2.1-型和2-型GDAs对脊髓胶质瘢痕形成的作用

如实施例1所述，使用BMP-4作为诱导信号从GRP细胞产生的 GDAs的移植显示神经突生长。在病灶动物中可见行为复原、内源性星 形胶质细胞的排列以及红核的保留。

GRP细胞应答BMP产生GFAP+/A2B5-星形胶质细胞(称作1-型 GDAs)，而且应答体外CNTF或LIF处理产生抗原性不同的星形胶质细 胞类型，即GFAP+/A2B5+(称作2-型GDAs)。因此，比较了病灶内移 植1-型或2-型GDAs对脊髓胶质瘢痕形成的作用。特别地，比较了在损 伤位点处移植效应介导的轴突生长抑制性CSPGs和转化生长因子β的水 平变化。

对接受了急性1-型GDAs移植的背柱穿刺损伤的共聚焦分析揭示， 相比于注射介质的对照，在损伤后第4天对抑制性CSPGs、神经蛋白聚 糖和NG2的免疫反应性显著遏制。然而，到损伤后第8天，病灶缘的神 经蛋白聚糖免疫反应性强度比对照损伤观察到的有所提高。类似地，接 受了GDA 1-型的病灶中心和病灶缘内的NG2免疫反应性相比于损伤后 第4天观察到的也明显提高，尽管在这一情况下，NG2免疫反应性的强 度相比于介质处理的对照仍旧降低。移植的1-型GDAs没有显示神经蛋 白聚糖免疫反应性并因此保留了1-型星形胶质细胞表型。移植的1-型 GDAs下调了其GFAP表达，然而，它们对星形胶质细胞谱系标志物S100 和波形蛋白的持续免疫反应性证实了星形胶质细胞表型的保留。因此， 移植1-型GDAs到急性损伤促进对抑制性CSPGs的显著地但瞬时地遏 制，有效地促进轴突跨损伤位点生长。

相比于1-型GDAs，移植的2-型GDAs不遏制脊髓疤的形成。损伤 后8天对2-型GDA桥接损伤的神经蛋白聚糖免疫反应性的共聚焦分析 显示不同于1-型GDAs，移植的2-型GDAs展示相当量的神经蛋白聚糖 +/hPAP+细胞，尤其在于邻近损伤边缘的移植物区域。对于CSPG表达。 移植的2-型GDAs也保留其表型。类似地，在损伤后8天观察到广泛分 布的、与GRPs病灶内移植相关的神经蛋白聚糖表达。神经蛋白聚糖是 有力的抑制性CSPG，已知由内源性活性星形胶质细胞在CNS损伤内表 达(Jones，et al.，Exp.Neurol.182：399-411 2003)。因此，神经蛋白聚糖 表达与含有GFAP+细胞的GRP移植物相关并且CNS损伤的环境促进胶 质前体分化成对轴突生长支持差的星形胶质细胞表型。1-型GDAs与 GRPs和2-型GDAs对比，移植到急性脊髓损伤后神经蛋白聚糖表达数 据与这些不同细胞类型支持轴突生长的各自能力以及功能性复原相一 致。

除了轴突生长抑制剂的表达之外，CNS瘢疤组织的另一被认为促 成轴突再生失败的主要特征是破坏白质途径的线性细胞结构学以及以 纤维化的胶质瘢痕组织呈现的物理屏障的形成。胶质瘢痕形成的典型指 示是在损伤边缘内形成的未对齐的增生性星形胶质细胞突起的网络。1- 型GDAs迁移出损伤位点与宿主GFAP+星形胶质细胞突起在病灶缘内 的排列相关。为了量化这一作用，发展了一种测量病灶缘内邻近宿主 GFAP+突起之间角度的方法，其在植入1-型GDA的损伤的情况下，利 用由这些细胞对GFAP免疫反应性的下调。在颈、背柱横断损伤边缘内 的星形胶质细胞突起分析揭示对照注射介质的损伤中平均角为59.4°， 对比1-型GDA处理的损伤中宿主星形胶质细胞突起仅仅11.6°。相比之 下，移植了GRPs或2-型GDAs的损伤缘显示出与在对照未处理的损伤 中观察类似的偏离的星形胶质细胞突起。尽管CNS损伤内的星形胶质 细胞突起的排列已经显示了不足以促进轴突再生(Davies，et al.，Exp. Neurol.142：203-16 1996)，对于接受了1-型GDAs的损伤，观察到轴突 生长穿过损伤位点的有效性以及减少的抑制剂表达。

实施例3.比较轴突生长跨GDA和GRP桥接的脊髓损伤

1-型GDAs移植进成年大鼠背柱途径穿刺损伤导致仅仅8天大约 40％示踪的内源性感觉轴突健壮的跨损伤位点再生。在大鼠中移植的1- 型GDAs支持GFP标记的轴突从成年DRG神经元的邻近移植物跨损伤 位点类似地高效生长。相比之下，病灶内移植未分化的GRPs导致GFP 轴突完全没能横穿损伤位点。这证明，胶质前体预分化成星形胶质细胞 表型对于它们支持轴突跨急性脊髓损伤的生长是必要的。2-型GDAs移 植到成年大鼠的相同背柱横断损伤处也不能提供轴突生长支持桥用于 新生GFP标记的感觉轴突跨过急性损伤。因此，不是所有的可以衍生自 胚胎胶质前体的星形胶质细胞类型都等同地支持体内轴突生长。

为了检验1-型GDAs促进功能复原的能力，横断背外侧索后接受了 1-型GDA移植体的大鼠在所有手术后时间点的Grid Walk行为试验中表 现比未处理的对照(具有或没有环孢菌素)明显更好并且其行为在损伤 后3天～28天持续显著改善(Two Way Repeated Measures ANOVA，p＜ 0.05)。接受1-型GDA移植体的大鼠在损伤后/移植后3天产生平均4.7 个错误并且在损伤后28天改善到平均2.9个错误。相反，对照病灶大鼠 在损伤后3天产生平均6个错误，并且在任何后续时间点没有显示出统 计学意义增加，在损伤后28天具有平均5.1个错误。手术之前，对照和 处理组的大鼠表现的一样好，具有基线平均2.0个错误。因此植入1-型 GDA的动物产生的平均错误数改善到仅在基线上0.9点，相比之下，对 照病灶大鼠在损伤后28天没有复原。另外，在第28天对各个大鼠的分 析显示接受了1-型GDA移植体的9只产生病灶的动物中4只如今与其 手术前的基线分数在统计学上相同。因此，1-型GDA移植体与损伤后 第3天的早期神经保护作用，和在损伤后4周内进一步复原都相关，暗 示RST轴突再生和/或保留的脊椎途径(例如，CST和脊椎固有的通路) 的可塑性的可能贡献。

这些数据证明移植的GRPs和2-型GDAs没能遏制瘢疤形成以及支 持轴突跨脊髓损伤生长。研究显示了GRPs在体外遏制谷氨酸盐介导的 神经毒性的能力(Maragakis，et al.，Glia 50：145-59 2005)。因此，保留 了急性移植的GRPs通过这一机制促进功能复原(可在损伤后第一周被 检测到的作用)的可能性。Grid Walk表现的分析在从损伤后3天～2周 的范围内又一系列接受了GRP细胞、1-型GDAs或对照介质注射的相比 较的RST病灶大鼠中进行。植入1-型GDA的大鼠再次显示运动功能在 损伤后所有时间点相比于对照的明显复原(Two Way Repeated Measures ANOVA，p＜0.05)，在第14天的病灶平均得分为1.5(±0.2)个错误， 相比于对照5.9(±0.2)个错误。相反，植入GRP的动物相比于对照 在损伤后所有时间没有显示出运动功能复原。这些结果证明需要胶质限 制性前体在移植到急性脊髓损伤之前预分化以促进功能复原。

移植的1-型和2-型GDAs促进运动复原的能力也在产生病灶的成年 大鼠中比较。在损伤后3天～4周的范围内对Grid Walk表现的分析显 示1-型GDA处理的大鼠显示功能稳健的复原，其程度和时间过程与在 早前实验观察到的密切一致(图15)。然而接受了急性2-型GDAs移植 的大鼠相比于未处理的对照，Grid Walk表现在研究的所有时间没有显 示统计学上显著的复原(图15)。这是第一次证明与向成年中枢神经系 统移植不同类型的星形胶质细胞相关的功能结果的差别。

本领域的技术人员将认识到或者只是使用常规实验就能够确定本 文描述的方法和组合物的具体实施方式的许多等效物。旨在将这些等效 物包含于所附权利要求中。