lncRNA AK095203在胃癌进展中的机制研究及氧化铈纳米颗粒治疗胃癌的研究

摘要

肿瘤的化疗耐药是导致肿瘤患者治疗过程中死亡的主要原因，但肿瘤化疗耐药具体的分子机制并不清楚。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度大于200nt的非编码RNA。目前越来越多的研究表明，lncRNA在肿瘤的发生发展过程中，发挥着重要的作用。lncRNA发挥作用的机制较为复杂，近年来文献指出，lncRNA可以通过吸附microRNA间接调控基因的表达，参与肿瘤进程;可以通过吸附蛋白，对蛋白进行修饰，从而通过调控蛋白水平发挥作用;也可以在细胞核中富集，通过招募或者阻碍某些核转录因子结合，在基因的表达层面发挥调控作用;还可以实现对核小体空间的重新构向，继而改变基因的表达。lncRNA丰富的调控机制，使得lncRNA在肿瘤的发生发展过程发挥多种不同的功能。目前已有文献报道，某些lncRNA参与了肿瘤的化疗耐药过程，可能是导致肿瘤化疗耐药的关键因素。因此，研究lncRNA在肿瘤化疗耐药中的关键作用，将可以阐明肿瘤发生化疗耐药的新机制，补充肿瘤进展的理论依据，为临床治疗提供新的策略和药物作用靶点。
　　目的:本研究通过筛选在胃癌组织中高表达的lncRNA，并分析其在胃癌化疗耐药中的作用。
　　方法:
　　(1)通过lncRNA芯片筛选出在胃癌组织中高表达的lncRNA;
　　(2)通过qRT-PCR技术，在60例胃癌患者中检测该lncRNA的表达水平，并结合临床病理资料，分析该lncRNA的临床相关性;
　　(3)检测该lncRNA在不同胃癌细胞中的表达情况，并通过干扰慢病毒在高表达该lncRNA的胃癌细胞中降低其表达，形成稳定低表达的胃癌细胞系作为模型;
　　(4)采用CCK8实验、Transwell实验、划痕实验、流式细胞仪检测细胞周期、裸鼠皮下成瘤实验、裸鼠腹腔转移实验、裸鼠尾静脉转移实验，对该lncRNA的功能进行检测;
　　(5)通过原位杂交技术，检测lncRNA在胃癌细胞和胃癌组织中的定位情况;
　　(6)通过表达谱芯片分析该lncRNA参与细胞的具体功能;
　　(7)通过RNA pull-down技术检测该lncRNA可能结合的蛋白，并分析其余lncRNA功能之间的关系;
　　(8)检测lncRNA的表达对于胃癌细胞奥沙利铂敏感性的影响。
　　结果:
　　(1)筛选在胃癌组织中高表达的lncRNA:我们通过lncRNA芯片筛选出在胃癌组织中高表达的lncRNAs，并通过表达倍数、表达特异性筛选出15条在胃癌组织中高表达的lncRNA。同时在10例胃癌患者癌组织和癌旁组织中进行验证，最终确定表达差异最明显且最有统计学意义的lncRNA为lncRNA AK095203。
　　(2)lncRNA AK095203在胃癌组织中的表达情况及其临床意义:我们通过qRT-PCR实验，在60例胃癌组织和癌旁组织中检测lncRNA AK095203的表达情况，发现lncRNAAK095203在胃癌组织中高表达(P=0.00662)，且lncRNA的表达与胃癌大小呈正相关，与胃癌分化程度呈反相关。
　　(3)lncRNA AK095203的表达对胃癌细胞行为学的影响:我们通过构建稳定低表达的胃癌细胞株SGC7901和BGC823，CCK8实验发现lncRNA AK095203的低表达，胃癌细胞的增殖能力受到了明显抑制;流式细胞仪检测细胞周期发现，干扰lncRNAAK095203的表达后，胃癌细胞难以进入G2期;Transwell实验和划痕实验表明，干扰lncRNA AK095203可以明显抑制胃癌细胞的侵袭和迁移能力;裸鼠皮下成瘤实验、裸鼠腹腔种植转移实验、裸鼠强制肺转移实验则从体内实验角度证明了干扰lncRNAAK095203的表达，胃癌细胞的增殖和侵袭能力受到了明显抑制。
　　(4)lncRNA AK095203在胃癌细胞和组织中的定位:我们通过原位杂交实验发现，lncRNAAK095203主要在细胞核中富集。
　　(5)表达谱芯片分析lncRNA AK095203的具体功能:我们通过表达谱芯片检测发现，干扰lncRNA AK095203的表达后胃癌细胞的细胞分裂相关基因、DNA损伤修复相关基因的表达受到了明显抑制，提示lncRNA AK095203与细胞分裂、DNA损伤修复密切相关。
　　(6)我们通过RNA pull-down实验发现，lncRNAAK095203可以与SSRP1和H2A/H2B结合，而SSRP1与胃癌奥沙利铂导致的DNA损伤修复密切相关，lncRNAAK095203可能是通过与SSRP1结合，从而导致胃癌奥沙利铂耐药的。
　　(7)我们发现干扰lncRNA AK095203的表达后，胃癌细胞SGC7901和BGC823对奥沙利铂敏感性明显增加。
　　结论:
　　(1)我们通过lncRNA芯片和qRT-PCR实验，筛选出一条在胃癌组织中高表达的lncRNA，即lncRNA AK095203，并通过临床病理资料分析发现，该lncRNA的表达与胃癌大小、分化程度密切相关。
　　(2)转染干扰慢病毒，形成稳定抑制lncRNA AK095203表达的细胞系，并通过体内体外实验发现，干扰lncRNA AK095203的表达，胃癌细胞的增殖能力、侵袭能力受到了明显抑制。
　　(3)表达谱芯片显示，lncRNA AK095203的表达，与细胞分裂功能、DNA损伤修复关系密切。
　　(4)通过RNA pull-down实验和原位杂交联合免疫荧光实验，我们初步证明lncRNAAK095203可以与SSRP1和H2A/H2B结合。干扰lncRNA AK095203的表达，胃癌细胞对奥沙利铂的敏感性明显增加。

目录

声明

英文缩写一览表

第一章 前言

参考文献

第二章 通过lncRNA芯片和qRT-PCR技术筛选出在胃癌中高表达lncRNA AK095203，且与胃癌大小、分化密切相关

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

2．5 小结

参考文献

第三章 lncRNA AK095203表达水平对胃癌细胞行为学的关系

3．1 实验材料

3．2 实验操作步骤

3．3 实验结果

3．4 讨论

3．5 小结

参考文献

第四章 lncRNA AK095203可能通过桥接SSRP1和H2A／H2B发挥DNA损伤修复功能

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．3 实验结果

4．4 讨论

4．5 小结

参考文献

第一章 前言

参考文献

第二章 氧化铈纳米颗粒抑制胃癌细胞增殖和侵袭

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

3．3 实验结果

3．4 讨论

2．4 讨论

2．5 小结

参考文献

第三章 氧化铈纳米颗粒抑制胃癌细胞增殖和转移的机制研究

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．5 小结

参考文献

全文总结

文献综述(已发表在Oncology Report) MicroRNA Detection in Feces，Sputum，Pleural Effusion and Urine：Novel Tools for Cancer Screening

攻读博士期间发表的论文情况

致谢