血栓内微泡介导超声增强尿激酶溶栓实验及临床研究

摘要

背景:
　　血栓性疾病是临床常见病、多发病，目前的治疗方式主要是抗凝治疗和溶栓治疗。抗凝治疗能防止血栓继续进展，但不能清除已有血栓。溶栓治疗主要包括经静脉溶栓和经导管溶栓，随着介入治疗的发展，导管溶栓已广泛应用于临床。该溶栓方式与系统溶栓相比，能将溶栓药直接送达血栓，提高血栓内部的药物浓度，从而提高溶栓率，但有研究发现该方法的远期疗效并不明显优于经静脉溶栓。
　　超声溶栓是近年来的研究热点，主要利用超声的热效应、机械效应及空化效应，以空化效应为主。而空化效应的强度与是否有微泡参与密切相关。微泡作为空化核，是诱导空化效应的关键因素。但大多数临床需要救治的血栓均为梗阻性血栓，经静脉注射的微泡无法进入血栓内部，造成血栓内空化核不足，不利于超声空化。因此，本研究利用溶栓导管，将微泡送到血栓内部，使血栓成为超声空化的良好靶区，并结合治疗超声，实现血栓内微泡介导的超声溶栓。
　　目的:
　　基础研究部分，探讨血栓内微泡介导的超声对体外血栓的尿激酶溶栓增强作用，为进一步进行临床研究奠定基础。临床研究部分则在基础实验的结果上，探讨经导管血栓内注射微泡介导的超声溶栓对下肢深静脉血栓的尿激酶溶栓效果，以进一步评价该方法法的安全性及有效性。
　　材料与方法:
　　第一部分
　　1.实验材料:
　　1.1 体外循环装置:该装置由水槽、微量蠕动泵和自制模拟体循环的管道组成，其中循环管道有侧枝循环。循环液为含10％新鲜冰冻牛血浆的磷酸缓冲盐溶液(Phosphatebuffer saline，PBS)，流速为5 ml/min。整个循环装置置于37℃恒温水浴锅中。水槽底部有2 cm厚的吸声海绵，用以减少反射波。
　　1.2 超声溶栓仪:本实验中使用的超声溶栓仪为由深圳市威尔德医疗电子有限公司生产的SL-10型超声溶栓仪。超声治疗参数为:频率2MHz，声压708kPa，占空比5％，辐照时间为10min，超声治疗头置于血栓正上方5cm处。
　　1.3 血栓制备:在EP管(内径0.9cm)中，先加入5％的氯化钙溶液33ul，然后加入1ml新鲜牛全血，将EP管静置于37℃恒温水浴锅中温育3h后取出，用PBS液冲洗3遍，滤纸吸干后待用。共制备血栓50份。
　　1.4 尿激酶:注射用尿激酶粉剂，105 IU/瓶，用0.5ml0.9％氯化钠注射液将其溶解混匀后备用。
　　1.5 微泡:“脂氟显”，由新桥医院超声科自制，浓度约为(7-8)×109/ml，采用高速振荡90s制成脂质微泡待用。
　　2.实验方法:
　　2.1 实验分组:栓龄3h的牛全血血栓样品50份，按随机数表平均分为5组，分别为:
　　超声+微泡+尿激酶(US+MB+UK)组:血栓内注射微泡0.02ml(相当于0.9-1.7×107 MB)及尿激酶0.1ml（相当于2×104IU），外加超声辐照10 min;
　　超声+微泡(US+MB)组:血栓内注射微泡0.02 ml（相当于0.9-1.7×107 MB），外加超声辐照10 min;
　　超声+尿激酶(US+UK)组:血栓内注射尿激酶0.1ml(相当于2×104 IU)，外加超声辐照10min;
　　单纯尿激酶(UK)组，血栓内注射尿激酶0.1ml（相当于2×104 IU），不给于超声辐照;
　　对照(Control)组:本组不给予微泡、尿激酶和超声辐照，直接放置于循环管道中10min。
　　2.2 观察指标:
　　溶栓率:按照公式(W1-W2)/W1×100％计算并比较各组的溶栓率(W1表示处理前血栓质量，W2表示处理后血栓质量)。
　　HE染色:观察各组血栓结构变化，评价血栓溶解情况。
　　免疫荧光染色:观察各组血栓纤维蛋白荧光染色情况，根据纤维蛋白荧光分布和强度评价血栓溶解效果。
　　第二部分
　　1.研究分组:
　　对血浆D-D＞500μg/L，且超声检查发现DVT的患者，根据入组标准、排除标准和剔除标准，纳入符合要求的25-70岁的急性期内(＜14d)下肢中央型或混合型深静脉血栓患者。该临床试验在郑州大学第一附属医院进行。
　　试验组:按照入组标准、排除标准和剔除标准，纳入符合要求的患者进行该临床试验。受试者在实施CDT治疗的同时，结合IMUT方法，观察两者联合治疗下肢DVT的安全性，并评价该方法的有效性。
　　历史对照组:根据研究对象入组标准，并剔除治疗时间大于10d的患者后，收集该院2014年-2015年期间接受单纯CDT治疗的患者，作为历史对照组。
　　2.仪器及试剂:
　　超声溶栓仪:同第一部分1.2。超声治疗参数:频率为1MHz，占空比为1％，声压根据血栓深度调节。当血栓深度大于或者等于3 cm时，声压设置为1.0MPa;当血栓深度小于3cm时，声压设置为0.75MPa。
　　溶栓导管:本研究使用美国Angio Dynamics公司生产的UniFuseTM导管，该导管采用闭塞导丝设计和激光切缝技术。
　　造影剂:本研究使用注射用六氟化硫微泡，即SonoVue(@)。
　　尿激酶:本研究使用注射用尿激酶，2×105 IU支，粉末状，使用前用生理盐水配置成50ml。
　　3.试验方法:
　　3.1 试验组:纳入研究后，首先经腘静脉顺行置入溶栓导管，并采用经导管超声造影方法确定血栓走形和位置，划线标记血栓体表投影，以此作为超声治疗的声窗;然后实施血栓内微泡介导的超声溶栓，即借助溶栓导管，在泵注尿激酶的同时，缓慢地将稀释后的SonoVue⑧推注到血栓内，同时在血栓的体表投影处给予超声辐照。SonoVue(@)稀释4倍，即5ml稀释到20ml，推注速度为每1.5min推注稀释液1ml。超声治疗头以每2cm血栓长度治疗1.5min的速度移动，直至覆盖整个血栓中央部分（从髂外静脉至腘静脉部分）为止。每天连续治疗两次。
　　3.2 历史对照组:仅给予单纯经导管溶栓治疗。
　　3.3 评价指标:
　　3.3.1 安全性评价:
　　隔天检测一次血常规、凝血功能和D-D，每天观察患者有无咳嗽、胸痛等症状，并监测血压。
　　3.3.2 有效性评价
　　溶栓治疗时间:比较试验组和对照组的治疗时间，以评价血栓溶解速度及该方法的有效性。
　　总尿激酶用量:比较试验组和对照组的总尿激酶用量，以评价该方法的有效性。
　　3.3.3 不良反应评价
　　观察患者有无出血、感染、肺栓塞等不良反应。
　　结果:
　　第一部分
　　1.溶栓率:US+MB+UK组为(73.64±14.16)％，US+MB组为(47.97±11.66)％，US+UK组为(57.33±8.65)％，UK组为(50.85±9.63)％，Control组为(29.76±18.06)％。其中US+MB+UK组溶栓率高于其余各组，且差异均有统计学意义(P＜0.05)。
　　2.HE染色:US+MB+UK组较其余各组，镜下血栓溶解灶更多，且边缘血栓崩裂明显;其余各组血栓结构仍较致密，尤其是Control组。
　　3.免疫荧光染色:US+MB+UK组可见大量纤维蛋白网断裂，仅见少量绿色荧光标记的纤维蛋白，其余各组绿色荧光明显，Control组绿色荧光最强。
　　第二部分
　　1.试验组共入组患者14例，历史对照组共收集患者23例。试验组与对照组间性别、年龄及发病天数无统计学差异(P＞0.05)。
　　2.试验组1例患者出现穿刺点出血，较轻微，转归好;无患者出现血常规及凝血功能明显异常，无患者出现呼吸困难、胸痛等肺栓塞症状。
　　3.试验组治疗时间（5.21±1.53）d，尿激酶总用量（3.91±1.66）×106 IU;对照组治疗时间（7.65±2.27）d，尿激酶总用量（4.41±1.93）×106 IU，两者的治疗时间和尿激酶总用量差异均有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.血栓内微泡介导超声联合尿激酶溶栓在体外实验中可显著提高血栓的溶解率。
　　2.血栓内微泡介导超声联合尿激酶溶栓在治疗下肢深静脉血栓中，能缩短治疗时间，减少尿激酶用量，且无明显不良反应，证实了该方法的安全性和有效性。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 血栓内微泡介导超声增强尿激酶溶栓体外研究

2．1 材料方法

2．2 实验结果

2．3 讨论

第三章 血栓内微泡介导超声增强尿激酶溶栓的II缶床研究

3．1 材料方法

3．2 试验结果

3．3 讨论

全文总结

本研究的局限性与今后的研究方向

参考文献

文献综述 经导管溶栓治疗下肢深静脉血栓的研究进展

攻读学位期间研究成果

致谢