蜜炙黄芪多糖诱导肿瘤细胞免疫原性死亡的实验研究

摘要

背景：近年来，从天然药材中分离与提取有效的抗肿瘤活性成分，可能成为一种肿瘤治疗的新策略，引起研究者们的极大关注。黄芪是天然药材中研究最多的，其主要有效化学成分包括：黄芪多糖(astragalus polysaccharides.APS)、黄芪皂苷(astragaloside)、黄芪黄酮（astragalus flavone）等。黄芪多糖是具有广泛药理作用的活性物质，如抗肿瘤、免疫调节、治疗心血管疾病及糖尿病等。蜜炙黄芪多糖（honey-processing Astragalus polysaccharides，HP-APS）是黄芪经过蜜炙后所提取的多糖，与APS相比较，HP-APS生物活性及药效得以提高。黄芪多糖的抗肿瘤作用可通过免疫调节功能实现，推测肿瘤细胞的免疫原性死亡可能是免疫调节类抗肿瘤药物的关键机制。因此，本课题主要探究HP-APS与APS对肿瘤细胞的免疫原性的影响及其抗肿瘤分子机制相关性研究。
　　目的：考察蜜炙黄芪多糖及黄芪多糖的抗肿瘤免疫活性及其对肿瘤细胞的免疫原性死亡影响。
　　方法：
　　1.采用水提醇沉法提取蜜炙黄芪多糖，通过凝胶色谱进一步分离纯化，硫酸苯酚比色法测定黄芪多糖和蜜炙黄芪多糖的含量。
　　2.采用CCK8法检测HP-APS和APS对人的肺癌细胞A549，小鼠的结肠癌细胞MC38，小鼠的黑色素瘤细胞B16的细胞增殖的影响。
　　3.采用Annexin V与7AAD联合染色，检测HP-APS和APS对A549、MC38、B16的凋亡影响，同时采用PI染色法检测其对A549细胞的周期影响。
　　4.采用流式细胞术检测HP-APS和APS对A549、MC38、B16的钙网蛋白（calreticulin，CRT）表达的影响，及其对A549、MC38、B16细胞MHC-I,CD86，CD80分子的表达影响。
　　5.采用酶联免疫吸附剂测定法（ELISA）测定HP-APS和APS对A549、MC38、B16细胞的免疫原性死亡信号分子三磷酸腺苷( ATP)释放的影响。
　　6.采用流式细胞术检测HP-APS和APS对小鼠细胞系DC2.4和小鼠原代DC细胞的表面标志的表达水平的影响。
　　7.构建C57/B6小鼠的B16细胞的黑色素移植瘤动物模型，分别研究HP-APS对荷瘤小鼠肿瘤体积及瘤重的影响
　　结果：
　　1.分离纯化得到黄芪多糖和蜜炙黄芪多糖的含量分别为:67.22％±0.58%与69.81±0.76%。
　　2.HP-APS和APS在浓度为5mg/mL-10mg/mL这浓度范围内对A549、MC38、B16的均显示了细胞毒性作用，并且呈一定的浓度依赖性。当HP-APS浓度提高为10mg/mL时，对A549、MC38、B16最大的抑制率分别为：48.90±0.98%、42.60±0.89%、48.40±1.35%。
　　3.HP-APS在5mg/mL-10mg/mL的浓度范围内均可促进A549、MC38、B16的凋亡。当HP-APS的浓度为10mg/mL时，各细胞株凋亡率分别为：18.8%，9.82和12.9%；在相同浓度下，HP-APS对A549细胞在G0/G1期的含量为：60.3±3.48%。
　　4.HP-APS能够促进A549细胞表面的CRT、MHC-I及Hsp70分子的表达显著升高。当HP-APS的浓度为10mg/mL时，CRT、MHC-I及Hsp70在A549细胞表面表达的平均荧光强度分别为388.80±9.60、4734.66±58.58、494.66±18.58，与空白对照组有显著性差异（P＜0.05）。HP-APS亦能促进MC38和B16细胞表面的CRT、MHC-I，CD86的表达，且与空白组相比，差异显著（P＜0.05）。
　　5.HP-APS能促进小鼠DC2.4细胞表面的CD80、CD86及MHC-I表达提高。当浓度为10mg/mL时其相对应的荧光表达强度为：805.00±10.53、1433.02±23.02、128.00±6.53。HP-APS在浓度为10mg/mL时，与空白组比较，能显著增强小鼠骨髓DC细胞表面的CD11c、CD80及MHC-I的表达，相对应的荧光强度分别为：22628.00±116.32、11390.33±123.55、118.00±4.32。
　　6.经ELISA测定HP-APS对A549、MC38、B16细胞中ATP的释放,在5mg/mL至10mg/mL的浓度范围内，ATP的释放量与浓度呈线性关系，当浓度为10mg/mL时，ATP的释放量分别为：3834.38±24.59、3021.53±96.80、2276.53±43.84。
　　7.HP-APS的体内作用表明，实验组在小鼠肿瘤体积，瘤重显著降低，肿瘤生长速度明显较缓慢。
　　结论：HP-APS和APS能诱导相关肿瘤细胞的免疫原性死亡。其机制可能是通过增强ATP、HSP70、CRT表达诱导 A549的免疫原性死亡，提高MHC-I、CD86和CD80的表达，诱导A549、MC38、B16细胞的凋亡，阻滞A549细胞于G0/G1期。以及促进小鼠骨髓DC细胞的成熟，更进一步活化抗原提呈细胞增强抗原提提作用，从而提高抗肿瘤作用。

目录

声明

第一章 引言

1.1 黄芪多糖

1.2 肿瘤细胞免疫原性死亡的形成

1.4 肿瘤细胞免疫原性死亡相关蛋白：钙网蛋白

1.5 肿瘤细胞免疫原性死亡相关信号分子：细胞外ATP

1.6 肿瘤细胞免疫原性死亡相关蛋白：高迁移率族蛋白B1

第二章 黄芪多糖和蜜炙黄芪多糖的提取及含量测定

2.1 仪器和试剂

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

第三章 蜜炙黄芪多糖诱导人肺癌细胞A549的细胞免疫原性死亡

3.1 仪器和试剂

3.2 实验方法和步骤

3.3 实验结果和分析

第四章 蜜炙黄芪多糖诱导小鼠结肠癌和黑色素瘤细胞的免疫原性死亡

4.1 仪器和试剂

4.2实验方法和步骤

4.3 结果和分析

第五章 蜜炙黄芪多糖促进小鼠树突状细胞的成熟

5.1 仪器和试剂

5.2 实验方法和步骤

5.3. 实验结果与分析

第六章 蜜炙黄芪多糖对小鼠移植瘤抑制实验

6.1 仪器和试剂

6.2 实验方法和步骤

6.3 C57/B6小鼠黑色素移植瘤模型的构建

6.4 统计学分析

6.5 实验结果和分析

第七章 总结与展望

参考文献

攻读学位期间发表的论文

附录

致谢