白脉散有效成分组BMECG促神经干细胞增殖的生物网络调控机制研究

摘要

近年来，脑卒中呈现发病低龄化、恶性化的趋势，目前的治疗多限于对半暗带未损伤组织及细胞的保护、康复理疗等，疗效有限、复发率高。最新研究表明，患者脑内的神经干细胞可以通过调控增殖分化为功能神经元，进而促进脑功能重塑，是治疗脑卒中神经病变一个重要方向。 随着对神经干细胞增殖分化机制认识的逐渐深入，以“有效成分组”理论、“网络药理学”理论为基础，多通路、多靶点角度研究中药、民族药调控内源性NSCs增殖与分化的机制对于开发脑梗死及其神经病变有效治疗药物意义重大。有效成分组BMECG是近年来从复方白脉散中利用提取分离和筛选技术获得的一个组分药物，含有人参皂苷Rg1、胡黄连苷Ⅱ、牛磺酸、没食子酸、鞣花酸等活性成分，具有神经保护、抗氧化、抗凋亡作用，值得深入研究。前期发现并证实了BMECG具有促进NSCs增殖的活性，其分子机制值得深入研究。本研究将在前期工作的基础上继续从细胞、整体水平评价其药理活性，初步探究BMECG调控神经干细胞增殖分化的分子机制。 方法: 1.神经干细胞增殖模型的制备方法。取一日龄Wistar乳鼠大脑皮层及深处组织，利用常规无血清悬浮培养技术分离纯化获得NSCs克隆球;建立NSCs氧糖剥夺复供模型(OGD/R)，各组细胞分别给予阳性药Rg1、BMECG高、中、低剂量，观察样品对NSCs的抗损伤及促增殖作用。 2.利用全转录组表达谱芯片技术检测基因的差异表达。选取模型组及BMECG高剂量给药组，筛选BMECG调控OGD/R损伤后NSCs的表达差异基因，并进一步对表达差异基因进行GO分析和Pathway分析，筛选与神经干细胞增殖分化相关的基因及信号通路。 3.建立小鼠全脑缺血再灌注模型。利用HE染色法观察病灶半暗带脑组织的病理变化;采用平衡转棒仪评价BMECG对缺血再灌注小鼠行为学的影响;免疫组织化学法检测NSCs标志性蛋白Nestin的表达变化情况，从整体水平探究BMECG抗脑缺血作用及机制。 4.检测BMECG对神经干细胞和模型动物脑组织中Notch、Wnt、及Hh三条信号通路的影响。采用RT-PCR技术研究NSCs和动物模型Notch1、Hes1、β-Catenin、CyclinD1、Gli1五个关键节点基因的表达变化;免疫印迹技术(Western blot)检测Hes1蛋白含量的变化。 结果: 1.与空白对照组相比，模型组氧糖剥夺6h后复供可显著降低体外培养NSCs的存活率(P＜0.01);BMECG各剂量及阳性药人参皂苷Rg1给药后可显著提高神经干细胞活力(P＜0.01，P＜0.05)，且呈现剂量依赖性，阳性药的作用BMECG中剂量组相近。 2.与模型组相比，BMECG组表达差异基因涉及结合活性、催化活性、分子转导活性等分子功能，参与细胞周期、增殖、凋亡等细胞调节过程;微小染色体维持蛋白家族(MCMs)、Sox2ot、Dcx、Xdh、Pon2等与神经干细胞保护及增殖分化调控相关基因的表达发生变化;Pathway分析结果表明差异基因主要涉及与神经干细胞增殖分化相关的Notch、Wnt、JAK/STAT、MAPK、Hedgehog(Hh)等多条信号通路，为进一步研究其分子机制提供初步研究依据。 3.病理学研究结果显示，全脑缺血再灌注后小鼠脑组织出现明显的结构疏松且细胞排列紊乱、核固缩等病理变化，阳性药Rg1及BMECG给药可在不同程度上改善损伤。模型组小鼠的在棒时间较空白对照组显著减短(P＜0.01)，阳性药Rg1及BMECG给药均可延长小鼠的在棒时间(P＜0.05，P＜0.01)。Nestin蛋白免疫组织化学检测显示，脑缺血损伤可上调标志性蛋白Nestin的含量，且给药7天后其含量较模型组显著增多。 4.细胞水平上RT-PCR检测结果显示，OGD/R损伤可降低神经干细胞中Hes1、β-Catenin、Gli1的表达，BMECG及阳性药Rg1均上调以上三个因子的转录水平(P＜0.05，P＜0.01)，其中Hes1、Gli1的转录水平变化率与BMECG给药剂量成正比，β-Catenin则与之成反比。 整体水平上RT-PCR检测结果表明，脑缺血再灌注后脑组织中Notch信号通路的关键节点--Notch1、Hes1和Hh信号通路的关键转录因子Gli1表达均较空白对照组显著上调(P＜0.01)，阳性药及BMECG高、中、低剂量可促进各节点基因的表达(P＜0.05，P＜0.01)，而BMECG低剂量组Hes1基因表达变化不具有显著性;Wnt信号通路的标志性节点β-Catenin在脑缺血后出现异常性的表达上升，阳性药及BMECG高、中剂量给药后其表达量下降（P＜0.01），但仍高于空白对照组，BMECG低剂量组β-Catenin的表达较模型组无显著性差异。作为多条通路的共同靶点，空白对照组与模型组间CyclinD1基因的表达量无显著变化，然而阳性药及BMECG高、中剂量给药后可较模型组显著上调CyclinD1的表达(P＜0.01)。Western blot检测表明各组Hes1基因在翻译水平上的表达变化与转录水平保持一致。 结论: 本研究在细胞和整体两个水平证实白脉散有效成分组BMECG具有抗脑缺血损伤、促进神经干细胞增殖的作用;首次发现BMECG主要通过调节Notch、Wnt、Hh三条通路中的Notch1、Hes1、β-Catenin、Gli1、CyclinD1等关键节点因子的表达变化实现对NSCs增殖分化的调控;本研究初步证实白脉散有效成分组BMECG促NSCs增殖机制涉及Notch、Wnt、Hh等多条信号通路，是通过多途径实现对NSCs的增殖调控。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 前言

第一节 脑卒中的病理及治疗研究现状

一、脑卒中概述

二、脑梗死的治疗研究现状

第二节 神经干细胞增殖分化的分子信号通路调控研究进展

一、Notch信号通路及其对NSCs增殖分化的调控作用

二、Wnt信号通路及其神经干细胞调节活性

三、与神经千细胞增殖相关的其他信号通路

四、神经干细胞增殖分化分子网络机制研究的可行性分析

第二章 细胞水平初探BMECG促NSCs增殖的机制

第一节 实验材料

一、实验动物

二、主要实验仪器及器材

三、实验药品与试剂

四、主要试剂配制

第二节 实验步骤

一、神经干细胞的体外培养

二、神经干细胞氧糖剥夺复供(OGD／R)模型的制备

三、分组与给药

四、神经干细胞活力测定

五、BMECG调控神经干细胞增殖的全转录表达谱芯片检测

六、RT-PCR技术检测Hes1、β-Catenin、Gli1等关键节点基因的表达变化

第三节 实验结果

一、体外培养神经干细胞的形态观察

二、BMECG对OGD／R损伤后神经干细胞形态的影响

三、MTT法检测BMECG对损伤后NSCs细胞活力的影响

四、全转录组基因表达谱芯片检测结果

五、RT-PCR检测结果

第四节 讨论

第五节 实验小结

第三章 整体水平初步研究BMECG调控神经干细胞增殖的分子网络机制

第一节 实验材料

一、实验动物

二、实验仪器及器材

三、实验试剂及药物

四、常用试剂配制

第二节 实验方法

一、小鼠全脑缺血再灌注模型的建立

二、模型评价

三、实验动物分组与给药

四、行为学检测

五、病理学研究

六、RT-PCR技术检测Notch、Wnt、Hh等信号通路关键基因的表达变化

七、Westem blot检测脑组织中Hes1蛋白的表达变化

第三节 实验结果

一、实验动物的一般生存情况

二、转棒仪检测BMECG对全脑缺血再灌注小鼠的行为学影响

三、病理学检测结果

四、脑组织Nestin免疫组织化学染色结果

五、RT-PCR检测BMECG对Notch、Wnt、Hh等通路中关键基因表达的影响

六、脑组织Hes1蛋白的表达变化情况

第四节 讨论

第五节 小结

第四章 全文总结

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术成果目录