基于群体感应分析对虾优势腐败菌对副溶血弧菌毒力因子的影响

摘要

对虾优势腐败菌是分离自腐败凡纳滨对虾肉糜中的能引起对虾腐败变质的水产品优势腐败菌。本课题通过对10种分离所得对虾优势腐败菌的AHLs及AI-2信号分子生成量的检测，分别选取信号分子产生量较高的菌株研究其对不同条件下副溶血弧菌(VP)生长菌体密度、生物被膜(BF)形成、溶血毒力及信号分子生成量的影响情况。研究结果如下:
　　1.以对虾优势腐败菌为研究对象，通过对腐败菌AHLs和AI-2两类信号分子定性定量的检测，择选出生成量较高的腐败菌株，并对所选腐败菌进行信号分子活性变化的检测。结果显示，腐败菌上清粗提物AHLs诱导生物检测菌株JZA1水解X-gal的定性检测方法检测差异较大，生物特异性高，灵敏度低;腐败菌上清AHLs信号分子β-半乳糖苷酶活性半定量检测法检测差异小，适合腐败菌AHLs信号分子的定性定量检测;腐败菌上清诱导BB170发光的AI-2定性定量检测法检测结果较稳定;腐败菌AHLs和AI-2信号分子的生成与菌体密度及活力关系密切，AHLs随菌体生长逐渐累积，菌体生长进入平稳期后AHLs累积水平达到最高并保持稳定，AI-2随着菌体生长逐渐累积，菌体生长进入平稳期后AI-2活性快速降低。结果表明对虾优势腐败菌AHLs和AI-2两类信号分子的生成情况各异;腐败菌生长至18h-24h其AHLs和AI-2信号分子生成达到最高水平，而后AI-2类信号分子量迅速降低，而AHLs水平保持稳定。
　　2.以腐败菌对VP生物被膜形成及信号分子生成的影响为研究对象，对不同影响作用下VP菌体密度，生物被膜形成和信号分子生成的改变情况进行研究。结果表明，腐败菌胞体和上清粗提物对VP生物被膜的形成均有促进作用，其中上清粗提物的促进作用大;生物被膜培养48h的形成量比24h时的多。腐败菌上清粗提物对VP生长有抑制作用，在抑制菌体生长的基础上除生物被膜外，还对VP AHLs及AI-2的生成有促进作用;腐败菌上清粗提物在低剂量添加时，随添加量的增加对VP各指标的影响程度加深，但高剂量添加时，由于严重抑制菌体生长而使BF，AHLs及AI-2量相应降至极低，其中对BF形成的添加量正影响剂量范围为0～0.12％，对AHLs生成添加量的正影响剂量范围为0～0.1％，对AI-2生成添加量的正影响剂量范围为0～0.08％。腐败菌上清在VP生长调整期对其菌体密度的影响较显著，随后生长时期的影响作用减弱;在VP生长对数期及其之前对其BF形成和AI-2生成的影响作用显著，随后生长过程中的影响作用逐渐减弱;在VP24h生长期内，随生长的进行腐败菌上清对其AHLs的影响作用逐渐加强。表明VP生长不同时期，菌体生长及不同代谢产物对外源上清添加物的敏感度不同。
　　3.以腐败菌对VP溶血活力及溶血毒素(TDH)表达量为研究对象，对不同影响作用下VP菌体密度，兔血球细胞溶血活力及标准菌株ATCC33847 TDH表达量改变情况进行研究。结果表明，腐败菌胞体及上清均对受试VP溶血活力与生长密度有影响作用，其中胞体对VP溶血活力影响不明显，腐败菌上清粗提物对溶血力的影响作用较明显，以camtF上清提取物对3株受试VP溶血力的影响变化最大，溶血活力可增加约2倍。腐败菌胞体对VP生长有一定影响，其中camtE、camtF和camtG可抑制ATCC33847生长仅达原生长状态时的10.6％、16.6％、13.8％;腐败菌上清粗提物对VP生长抑制作用更明显，其中camtE对受试VP生长可抑制约为原状态的23％。腐败菌camtF上清对ATCC33847生长不同时期溶血活力的影响以12h时最大，可增加约3.54倍。腐败菌camtF上清对ATCC33847 tdh基因表达量的影响远大于其胞体的影响力，上清可提高上万倍。表明VP溶血活力及tdh基因表达量易受腐败菌上清影响，且腐败菌上清在VP生长对数前期加入时对其培养终液溶血活力的影响较大。ATCC33847小鼠致病力以对小鼠肝脏、肾脏、肺脏及胃的损伤作用最明显，腐败菌camtF上清可以增加VP对小鼠肝脏和肾脏损伤的可能性。

目录

声明

摘要

英文缩写及对照

1．前言

1．1 副溶血弧菌特性及其危害

1．1．1 副溶血弧菌生物学特性

1．1．2 副溶血弧菌的危害影响

1．1．3 副溶血弧菌主要危害因子

1．2 细菌菌群间的相互影响

1．2．1 菌群间相互影响现象

1．2．2 菌群间相互影响研究进展

1．3 细菌间的通讯与群体感应信号传导

1．3．1 群体感应概况

1．3．2 革兰氏阴性菌群体感应信号分子种类及检测方法

1．4 本研究目的意义、研究内容与创新点

1．4．1 研究目的与意义

1．4．2 研究内容

1．4．3 创新之处

2．对虾优势腐败菌信号分子的产生及活性变化

2．1 材料和仪器

2．1．1 菌种及培养条件

2．1．2 材料与试剂

2．1．3 设备与仪器

2．2 试验方法

2．2．1 菌株培养方法

2．2．2 腐败菌上清粗体物的制备

2．2．3 平板划线法定性检测AHLs

2．2．4 平板打孔法定性检测AHLs

2．2．5 AHLs信号分子β-半乳糖苷酶活性测定法

2．2．6 AI-2信号分子的检测

2．2．7 特定腐败菌48h动态生长密度及信号分子活性变化

2．2．8 数据处理与分析

2．3 结果与分析

2．3．1 平板划线法定性检测优势腐败菌AHLs生成情况

2．3．2 平板打孔法定性检测优势腐败菌AHLs生成情况

2．3．3 β-半乳糖苷酶活性法半定量检测对虾腐败菌AHLs的量

2．3．4 对虾腐败菌AI-2信号分子的量

2．3．5 特定腐败菌动态生长及信号分子活性变化

2．4 讨论

2．5 小结

3．特定腐败菌对副溶血弧菌生长、生物被膜形成及信号分子生成的影响

3．1 材料与仪器

3．1．1 菌种

3．1．2 试剂和材料

3．1．3 设备与仪器

3．2 方法

3．2．1 腐败菌上清粗体物的制备

3．2．2 生物被膜的定量检测方法

3．2．3 腐败菌胞体及其上清粗提物对VP生物被膜形成的影响

3．2．4 腐败菌上清粗提物对VP 48h动态生长密度及群体感应信号分子的影响

3．2．5 腐败菌上清粗提物添加量对VP动态生长密度及群体感应信号分子的影响

3．2．6 腐败菌上清粗提物在VP不同生长期添加对其生长密度及群体感应信号分子的影响

3．2．7 光学显微镜及扫描电镜观察VP生物被膜形成情况

3．2．8 数据处理与分析

3．3 结果与分析

3．3．1 腐败菌胞体对VP生物被膜形成的影响

3．3．2 腐败菌上清粗提物对VP生物被膜形成及生长的影响

3．3．3 腐败菌上清粗提物对VP生物被膜不同形成时间的影响

3．3．4 腐败菌上清粗提物对VP 48h生长密度、生物被膜及信号分子动态变化的影响

3．3．5 腐败菌上清粗提物添加量对VP动态生长密度及信号分子活性的影响

3．3．6 腐败菌上清粗提物在VP不同生长期添加对其生长密度及信号分子活性的影响

3．3．7 显微镜分别观察两种腐败菌及其上清粗提物对VP生物被膜形成的影响

3．4 讨论

3．5 小结

4．特定腐败菌对副溶血弧菌溶血活性及tdh基因表达的影响

4．1 材料与仪器

4．1．1 材料与试剂

4．1．2 仪器与设备

4．2 方法

4．2．1 血平板的制备

4．2．2 副溶血弧菌神奈川现象

4．2．3 兔血球溶血试验

4．2．4 溶血试验条件的确定

4．2．5 特定腐败菌胞体及上清粗提物对副溶血弧菌溶血活力的影响

4．2．6 平板计数法统计特定腐败菌胞体对副溶血弧菌菌体生长的影响

4．2．7 特定腐败菌上清粗提物不同添加量对副溶血弧菌溶血能力的影响

4．2．8 特定腐败菌上清粗提物对副溶血弧菌生长不同时期溶血能力的影响

4．2．9 荧光PCR检测副溶血弧菌tdh的表达

4．2．10 小鼠致病力试验

4．2．11 数据处理与分析

4．3 结果与分析

4．3．1 受试副溶血弧菌神奈川现象

4．3．2 溶血条件的确定

4．3．3 特定腐败菌胞体及上清粗提物对副溶血弧菌溶血力及菌体生长的影响

4．3．4 camtF上清粗提物不同添加量对副溶血弧菌溶血力的影响

4．3．5 特定腐败菌上清粗提物对不同生长期副溶血弧菌溶血力的影响

4．3．6 荧光PCR检测camtF胞体及提取物对副溶血弧菌tdh基因表达的影响

4．3．7 小鼠致病力试验

4．4 讨论

4．5 小结

5．总结与展望

5．1 总结

5．2 展望与不足之处

参考文献

致谢

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