转化生长因子β1基因多态性与慢性移植肾肾病关系的研究

摘要

慢性移植肾肾病(chronicallograftnephropathy，CAN)是移植肾慢性失功的最主要原因，细胞因子在慢性移植肾肾病发生中细胞活化、迁移、增殖和效应过程中发挥重要作用，其最终表现为器官实质和血管的纤维化以及功能丧失。转化生长因子β1(transforminggrowthfactor-beta1，TGF-β1)是目前己知的最重要的具有致纤维化作用的细胞因子。TGF-β1基因多态性决定TGF-β1的个体水平。在TGF-β1基因上信号序列区的+869和+915位置处存在着对应的T/C、G/C的变化。TGF-β1等位基因型别共有9种，分别为T/TG/G、T/CG/G、T/CG/C、C/CG/G、T/TG/C、C/CG/C、C/CC/C、T/TC/C帮T/CC/C，根据细胞因子基因型与血清细胞因子水平的关系，临床上将细胞因子的合成量分为高、中、低三种水平。TGF-β1等位基因分为3型：T/TG/G、T/CG/G为高分泌型，T/CG/C、C/CG/G和T/TG/C为中分泌型，C/CG/C、C/CC/C、T/TC/C和T/CC/C为低分泌型。高分泌型等位基因纯合子产生细胞因子量最高；低分泌型等位基因纯合子产生细胞因子量最低；高分泌型和低分泌型等位基因的杂合子产生中等量细胞因子。血清TGF-β1浓度高产量型是中低产量型的3～10倍。各种合成量的细胞因子对许多疾病的发生及病理过程产生不同的影响。据文献报道细胞因子基因多态性对心、肾、肝、肺等器官的移植效果均有影响。国内研究显示TGF-β1基因多态性与移植肾急性排斥反应没有明显联系，但与慢性移植肾肾病的关系尚未见报道。 目的：本研究探讨TGF-β1基因多态性与慢性移植肾肾病的关系。 方法：选取本单位经临床表现及病理确诊为慢性移植肾肾病的50例患者作为慢性移植肾肾病组(CAN组)，同时选取50例肾移植术后移植肾功正常患者作为对照组。对两组患者的TGF-β1“+869”和“+915”遗传突变位点的基因型进行测定。采用蛋白酶K消化酚氯仿抽提法自CAN组石蜡标本，全血DNA提取试剂盒自对照组静脉血标本中提取DNA模板。使用Primerexpress2.0生物软件设计合成引物，对抽提的DNA样本进行PCR扩增，扩增产物纯化，测序仪测序得出TGF-β1基因型。分析两组高产量基因型的百分率差异。再通过免疫组化染色(SABC法)检测CAN组移植肾中TGF-β1表达，对免疫组化染色结果观察判定，分析TGF-β1基因表现型为高产量及中低产量组中TGF-β1染色强度的差异。进一步对CAN组移植肾组织切片行HE染色，按照Banff97病理诊断分类标准进行分级，分析TGF-β1基因表现型为高产量及中低产量组中移植肾纤维程度的差异。 结果：CAN组中TGF-β1基因表现型为高产量者为70％(35/50)，对照组高产量者为38％(19/50)，CAN组中高产量型占优势，两组相比有显著差异(χ2=10.306P=0.001)。为了找出其它影响慢性移植肾肾病的可能因素，从而为在研究TGF-β1基因型多态性对慢性移植肾肾病的影响时剔除干扰因素，我们对可能影响慢性移植肾肾病的因素，包括性别、年龄、HLA配型、移植肾功能延迟恢复、急性排斥反应、免疫抑制维持方案、巨细胞病毒感染、高血压、高血脂等进行比较筛选，发现仅有急性排斥反应在两组间差异可能有意义，CAN组为36％(18/50)，对照组为20％(10/50)，两组相比(χ2=3.175P=0.075)。为了避免急性排斥反应干扰TGF-β1基因多态性对慢性移植肾肾病发生影响的结果，依据有无急性排斥反应再次分组，分析TGF-β1高及中低产量型在CAN组及对照组中分布显示：有急性排斥反应时，CAN组中TGF-β1高产量者为72.2％(13/18)，对照组高产量者为30％(3/10)，两组Fisher精确概率分析有差异(P=0.049)。无急性排斥反应时，CAN组中TGF-β1高产量者为68.8％(22/32)，对照组高产量者为40％(16/40)，两组相比有差异(χ2=5.896P=0.015)。行Mantel-Haenszel检验(p=0.542)显示有无急性排斥反应对CAN组及对照组中TGF-β1高产量率无影响，CAN组中高产量率明显高于对照组。CAN组免疫组化染色：TGF-β1阳性着色表现为胞膜及胞浆染成浅黄色、棕黄色、棕褐色，用半定量法估计TGF-β1染色。无阳性细胞为(-)，阳性细胞数占25％以下为(+)，占25-50％为(++)，大于50％为(+++)，大于75％为(++++)。高产量组TGF-β1染色强度++为2例，+++为10例，++++为23例。中、低产量组TGF-β1染色强度++为6例，+++为8例，++++为1例。Mann-Whitney检验显示两组有差异。TGF-β1高产量型在移植肾组织中有较高转化生长因子沉积，染色深。依照Banff97病理诊断分级标准：Ⅰ级轻度间质纤维化和肾小管萎缩伴或不伴有慢性排斥反应的特异改变，Ⅱ级中度间质纤维化和肾小管萎缩伴或不伴有慢性排斥反应的特异改变，Ⅲ级重度间质纤维化和肾小管萎缩、消失伴或不伴有慢性排斥反应的特异改变。对移植肾组织HE染色切片进行分级，高产量组Ⅰ级4例，Ⅱ级10例，Ⅲ级21例，中、低产量组Ⅰ级4例，Ⅱ级7例，Ⅲ级4例。Mann-Whitney检验显示两组有差异。高产量组移植肾病理改变重于中、低产量组。 结论：慢性移植肾肾病中TGF-β1基因表现型以高产量为主，高产量率显著高于移植肾功正常患者，提示TGF-β1高产量型与慢性移植肾肾病具有相关性。在慢性移植肾肾病肾组织中有大量转化生长因子沉积，高产量型高于中低产量型表达。分析TGF-β1高产量型及中低产量型中移植肾病理改变显示，高产量组纤维化程度重于中低产量组，转化生长因子的表达强度与肾脏纤维化程度相关。可以把TGF-β1基因型作为预测移植后慢性移植肾肾病发生危险程度的一个指标。对于TGF-β1基因高产量型的患者应于移植后不用那些能够增加TGF-β1的药物或减少其用量，以利于移植肾的长期存活。通过确定移植受者的细胞因子基因型，可了解血清细胞因子的大致水平，有可能在移植前评估移植后患者发生免疫排斥反应的危险程度，预测受者对移植物的反应情况，从而更加合理地指导使用不同的免疫抑制药物和免疫抑制剂方案。细胞因子基因型的测定相比复杂的细胞因子浓度测定更简单、稳定，有望成为移植前的常规检查项目。

目录

文摘

英文文摘

第一章前言

第二章转化生长因子β1基因多态性测定

第一节 材料与方法

第二节 结果

第三章免疫组化染色(SABC法)检测CAN组移植肾中TGF-β1表达

第一节 材料与方法

第二节 结果

第四章讨论

第五章参考文献

第六章缩略词

第七章成果

第八章致谢

第一军医大学学位论文原创性声明及学位论文版权使用授权书