人CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA MBL基因突变体在哺乳细胞中的表达及产物分析

摘要

甘露聚糖结合凝集素(MBL)系哺乳动物C型凝集素超家族中胶凝素家族的成员，是主要由肝细胞分泌的血浆糖蛋白。作为天然免疫系统的重要成份，MBL是补体凝集素激活途径的启动因子。近年来，越来越多的研究表明，各种病原体的反复感染与MBL缺损密切相关。人MBL基因位于染色体10q11.2-q21。现已发现3个可导致血清(浆)MBL水平低下并进而引起调理吞噬缺损的MBL结构基因点突变：CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA，其编码产物的改变分别是Arg(精氨酸)→Cys(半胱氨酸)、Gly(甘氨酸)→Asp(天冬氨酸)及Gly(甘氨酸)→Glu(谷氨酸)。这些点突变为常染色体共显性遗传，其基因频率在不同种族人群中差异甚大，但总体来说极高，如第52位密码突变在所研究过的人群中相对较低(≤0.1)，第54位密码突变在欧亚人群中有较高频率(0.11～0.14)，而第57位密码突变在撒哈拉非洲人群中的频率很高(0.23～0.29)。显然，MBL缺损是迄今所发现的最常见的免疫缺损病。因此，阐明MBL基因突变引起免疫缺损的机理具有极其重要的意义。 然而，目前尚不清楚MBL基因突变导致血清(浆)MBL水平低下的直接原因，究竟是分泌减少还是结构不稳定?为了深入研究MBL基因突变引起免疫缺损的分子机制，并进一步阐明MBL的结构与功能的关系，选择CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAAMBL突变体基因作为研究对象，将其在哺乳动物细胞中表达，并对瞬时表达和稳定表达的蛋白产物进行了初步分析。 一、抗人MBL抗原肽多克隆抗体的制备与鉴定在对天然MBL分子优势表位预测的基础上，合成B细胞识别表位15mer短肽NH2-EPGQGLRGLQGPPGK-COOH，将其与载体蛋白KLH偶联后免疫新西兰大白兔。经ELISA法检测抗体滴度为1：128000。采用抗原肽亲和层析纯化法获得抗人MBL抗原肽多克隆抗体MSA(MBLspecific-epitopeantibody)，其在3.32ng/ml时仍能检测到5μg/ml包被的抗原肽-OVA偶联物。Westernblot鉴定该抗体可与重组野生型MBL蛋白结合。 二、突变型和野生型MBL基因在COS7细胞中的瞬时表达本课题组前期工作己构建成含有MBL结构基因点突变的质粒pMBLm52、pMBLm54和pMBLm57。采用PrimerPremier5.0设计并合成一对特异性引物，从原有质粒中扩增出含有CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA的MBLcDNA序列并将其插入真核表达载体pcDNA4/HisMaxC中构建重组表达载体。测序结果表明，己构建成功含有目的基因的真核表达载体pcDNA4/HisMaxC-MBLm52、pcDNA4/HisMaxC-MBLm54和pcDNA4/HisMaxC-MBLm57。 应用脂质体转染法将具有相同质量数的重组野生型MBL真核表达载体pcDNA4/HisMaxC-MBLw和重组突变型MBL真核表达载体pcDNA4/HisMaxC-MBLm52、pcDNA4/HisMaxC-MBLm54和pcDNA4/HisMaxC-MBLm57分别转染相同数目的COS7细胞，72h后收集细胞培养上清。通过双抗体夹心ELISA法分析瞬时表达产物，同时以倍比稀释的重组野生型蛋白作标准曲线，对瞬时表达产物进行定量分析。经SPSS分析表明野生型MBL基因和突变型MBL基因在COS7细胞中的分泌水平并无明显差异。由此推论，MBL结构基因第一外显子的单碱基突变不影响蛋白的合成和分泌。 三、突变型MBL基因在CHO细胞中的表达及产物的分析将重组突变型MBL真核表达载体pcDNA4/HisMaxC-MBLm52、pcDNA4/HisMaxC-MBLm54和pcDNA4/HisMaxC-MBLm57分别电转染至CHO细胞。以800mg/LZeocin筛选转染后的CHO细胞30天；在随后的30天中维持Zeocin的浓度为200mg/L，以建立CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAAMBL突变体的哺乳细胞稳定表达系统CHO-MBLm52、CHO-MBLm54和CHO-MBLm57。结果表明，突变蛋白的多聚化程度远远低于野生型重组人MBL蛋白以及血清来源的天然MBL蛋白。配体结合实验也表明，只有高寡聚化的人血浆MBL和野生型MBL蛋白才能与甘露聚糖有效结合，3种突变型MBL蛋白因低寡聚化而丧失了与糖结合的功能。 综合上述结果认为，人CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAAMBL基因点突变并不影响产物蛋白的合成与分泌，但是Arg→Cys、Gly→Asp和Gly→Glu氨基酸残基的替换会影响蛋白的结构，进而影响其功能。

目录

文摘

英文文摘

前言

第1章抗人MBL抗原肽多克隆抗体的制备与鉴定

1.1材料与方法

1.2结果

1.3讨论

第2章突变型和野生型MBL基因在COS7细胞中的瞬时表达

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

第3章突变型MBL基因在CHO细胞中的表达及产物分析

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

全文小结

参考文献

英文缩略词表

攻读学位期间成果

致谢

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