鸭肠炎病毒部分基因结构及相关功能的初步研究

摘要

鸭病毒性肠炎(Duck viral enteritis,DVE),又名鸭瘟(Duck plague,DP),是由鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)引起的鸭、鹅及多种雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病,曾在多个国家和地区发生流行,给养鸭业造成巨大的经济损失.DEV是疱疹病毒科成员,第八次病毒分类报告将其划分为疱疹病毒科未分类病毒.由于DEV分子生物学研究相对滞后,其基因组组成和结构未知,在很大程度上限制了DEV致病机制及该病在防控方面的研究. 本研究根据本实验室提交至GenBank上的DEV clone-03部分基因组序列,选择在疱疹病毒中较为保守的囊膜蛋白UL27、主要衣壳蛋白UL19以及在绝大多数疱疹病毒成员基因组排列中保守的基因簇(UL22-FK.UL-24)进行测序.选取同源性较高的α-疱疹病毒同源蛋白作为参考毒株,应用DNAStar软件对5个基因进行序列比对,分析各个基因编码蛋白的保守区.结果表明,DEV clone-03 UL19和UL27保守,UL22次之,TK具有胸苷激酶特征性结构域:ATP结合结构域和核苷结合结构域.与HSV-1相似,UL24也存在5个保守位点.UL22和UL27编码的蛋白具有跨膜糖蛋白典型特征,UL22具有7个糖基化位点,6个跨膜区,在N末端1～21位氨基酸为信号肽序列,符合疱疹病毒gH糖蛋白的特点;UL27有9个潜在的糖基化位点,3个跨膜区,符合疱疹病毒gB糖蛋白的特点.此外,根据5个基因编码氨基酸序列进行系统发育进化分析,发现DEV clone-03与马立克病毒属亲缘关系较近,但又形成独立分支.根据这5个基因比较结果,建议将鸭肠炎病毒归类为疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科. 为了鉴定DEV clone-03结构基因,将DEV clone-03 UL19基因分成UL19-N、UL19-M、UL19-C三段进行原核表达并制备抗血清.同时表达UL27基因中段UL27-M和UL6基因的UL6-1和UL6-2二段,应用Western blot和间接免疫荧光方法检测6个重组蛋白的单因子血清与DEV clone-03全病毒的反应性.结果表明UL19-N、UL19-M和UL19-C三段蛋白制备的抗血清均能够与全病毒发生特异性反应,在大约150kDa处检测到特异性蛋白条带,大小与DNAStar软件预测的DEV clone-03 UL19蛋白大小一致,说明:DEV clone-03 UL19是病毒的结构蛋白,大小约为150kDa,结合与其他疱疹病毒同源蛋白共有的保守区,初步认为DEV clone-03 UL19可能是病毒的衣壳蛋白.应用Western blot方法检测UL27,未能够在DEV clone-03中检测到预期大小的蛋白条带,但是,应用间接免疫荧光方法检测,UL27-M抗血清能够与全病毒发生抗原抗体反应,说明DEV clone-03 UL27是病毒的组成成分,结合与其他疱疹病毒同源蛋白共有的保守区,以及UL27具有跨膜糖蛋白特征,推测.DEV clone-03 UL27可能是病毒的囊膜糖蛋白.应用UL6-2蛋白抗血清检测DEV全病毒,在大约88kDa处检测到特异性蛋白条带,与DNAStar软件预测DEV clone-03 UL6蛋白大小一致,结合其他研究报道,初步认为DEV clone-03 UL6是病毒的结构蛋白. 文中应用DNAStaz软件对上述检测抗原性较好的DEV clone-03 UL19蛋白从蛋白的亲水性、抗原性以及表面可及性进行表位预测,三段蛋白均存在抗原表位优势区,因此选取UL19-C段蛋白制备单克隆抗体,拟对UL19抗原表位进行初步定位.将UL19-C蛋白作为抗原免疫6-8周龄的BALB/c小鼠,制备单克隆抗体,经过3次克隆,分别采用间接EIASA、Western blot和间接免疫荧光方法筛选,最后得到4株(185、3A1、4F9、6F6)稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株.将DEV clone-03UL19-C分成两段进行表达,N端命名为ULl9-C1、C端命名为UL19-C2,二者有16个氨基酸的重叠.Western blot检测,4株单克隆抗体均能够识别UL19-Cl蛋白,而不能够与UL19-C2发生特异性反应,说明获得的4株单克隆抗体都是针对UL19-Cl蛋白的,即在DEV clone-03 UL19蛋白C端921～1162位氨基酸的片段内有能够被4株单克隆抗体识别的抗原表位.

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

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第一章绪论

1.1鸭病毒性肠炎概述

1.2鸭肠炎病毒生物学特性

1.2.1鸭肠炎病毒特性

2.2.2鸭肠炎病毒形态发生

1.3鸭肠炎病毒分子生物学研究进展

1.4鸭病毒性肠炎诊断方法研究进展

1.4.1综合分析流行病学、临床症状和病理变化

1.4.2病毒的分离和鉴定

1.4.3血清学方法

1.4.4分子生物学方法

1.5鸭病毒性肠炎的防制

1.5.1灭活苗

1.5.2弱毒疫苗

1.5.3治疗

1.6疱疹病毒分类及基因组结构

1.6.1疱疹病毒分类

1.6.2疱疹病毒形态结构

1.6.3疱疹病毒基因组结构

1.6.4疱疹病毒基因及其表达调节

1.6.5疱疹病毒主要结构蛋白

1.7 B细胞抗原表位的筛选

1.7.1抗原表位概述

1.7.2 B细胞抗原表位的研究方法

1.8研究的目的和意义

第二章鸭肠炎病毒部分基因系统发育进化分析

2.1材料与方法

2.1.1病毒与细胞

2.1.2质粒与菌种

2.1.3酶类及主要生化试剂

2.1.4主要仪器

2.1.5扩增引物

2.1.6鸡胚成纤维细胞的制备

2.1.7鸭肠炎病毒的增殖

2.1.8鸭肠炎病毒滴度的测定

2.1.9鸭肠炎病毒基因组DNA提取及PCR扩增

2.1.10基因的分子特征及系统发育进化分析

2.2结果

2.2.1鸭肠炎病毒在鸡胚成纤维细胞上的TCID50、细胞病变及蚀斑形态

2.2.2 DEV clone-03 UL19、TK及其侧翼序列及UL27的PCR扩增

2.2.3 DEV clone-03 UL19、UL22、TK、UL24及UL27基因的分子特征

2.2.4DEV clone-03系统发育进化分析

2.3讨论

2.3.1鸭肠炎病毒增殖

2.3.2鸭肠炎病毒部分基因的分子特征

2.3.3鸭肠炎病毒系统发育进化分析

第三章鸭肠炎病毒部分功能基因的鉴定

3.1材料与方法

3.1.1病毒与细胞

3.1.2质粒与菌种

3.1.3酶类及主要生化试剂

3.1.4主要仪器

3.1.5扩增引物

3.1.6鸡胚成纤维细胞的制备

3.1.7鸭肠炎病毒的增殖

3.1.8鸭肠炎病毒基因组DNA提取及PCR扩增

3.1.9 DEV clone-03 TK、UL19-N、UL19-M、UL19-C及UL27-M重组表达质粒的构建

3.1.10 DEV clone-03 TK、UL19-N、UL19-M、UL19-C及UL27-M表达及纯化

3.1.11 抗血清的制备

3.1.12 Western blot检测UL6、UL19及UL27

3.1.13间接免疫荧光检测DEV clone-03 UL6、UL19及UL27

3.1.14 DEV clone-03 UL19作为诊断抗原的初步应用

3.2结果

3.2.1 PCR扩增

3.2.2重组质粒p19N、p19M、p19C、pTK及p27M的鉴定

3.2.3重组表达质粒的鉴定

3.2.4重组蛋白的表达及纯化

3.2.5 DEV clone-03 UL6、UL19及UL27的Western blot鉴定

3.2.6 DEV clone-03 UL6、UL19及UL27的间接免疫荧光鉴定

3.2.7 DEV clone-03 UL19检测疑似鸭病毒性肠炎血清样品

3.3讨论

3.1.3表达载体的选择

3.3.2 DEV clone-03 UL19、TK和UL27的表达

3.3.3 DEV clone-03 UL19、TK及UL27的纯化和复性

3.3.4 DEV clone-03 UL19、UL27和UL6的鉴定

3.3.5 DEV clone-03 UL19检测鸭病毒性肠炎

第四章鸭肠炎病毒UL19抗原表位的初步定位

4.1材料与方法

4.1.1 病毒与细胞

4.1.2质粒与菌种

4.1.3酶类及主要生化试剂

4.1.4实验动物

4.1.5扩增引物

4.1.6主要仪器

4.1.7动物免疫

4.1.8间接ELISA检测方法的建立

4.1.9细胞融合

4.1.10阳性杂交瘤细胞的筛选

4.1.11杂交瘤细胞的克隆化

4.1.12细胞冻存及复苏

4.1.13单克隆抗体腹水的制备

4.1.14杂交瘤细胞及单克隆抗体特性的鉴定

4.1.15 DEV clone-03 UL19抗原表位的初步定位

4.2结果

4.2.1抗原的制备

4.2.2 ELISA筛选方法的建立

4.2.3动物免疫与抗体水平检测

4.2.4细胞融合率

4.2.5杂交瘤细胞株的建立

4.2.6腹水效价的测定

4.2.7杂交瘤细胞染色体分析

4.2.8单克隆抗体亚类鉴定

4.2.9单克隆抗体特异性鉴定

4.2.10 DEV clone-03 UL19-C1、UL19-C2基因片段的扩增

4.2.11重组质粒的鉴定

4.2.12重组表达质粒的构建

4.2.13 DEV clone-03 UL19-C1、UL19-C2的表达

4.2.14 DEV UL19抗原表位的初步定位

4.3讨论

4.3.1 DEV clone-03 UL19单克隆抗体的制备

4.3.2 DEV clone-03 UL19抗原表位的初步定位

第五章全文结论

参考文献

致 谢

作者简历