鸭肠炎病毒核衣壳蛋白基因结构与功能初步研究

摘要

[目的]：
　　通过对鸭肠炎病毒(DEV)核衣壳蛋白(NP)基因的克隆与表达分析，并从核苷酸和氨基酸水平上初步探索DEVNP蛋白的结构与功能，为DEV致病机理深入研究奠定基础和提供科学依据。
　　[方法]：
　　(1)以鸭肠炎病毒GZ株基因组为模板，通过PCR方法扩增该基因并将其克隆到pMD18-T载体上，构建NP重组质粒，转化到DH5α感受态细胞，对经PCR和酶切鉴定为阳性的重组菌进行序列测定。
　　(2)根据测定的DEVNP基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列，应用生物学软件对NP蛋白的二级结构、亲水性、抗原指数、柔韧性、表面可及性以及保守结构域、跨膜结构、磷酸化、糖基化、信号肽、亚细胞定位及三级结构等多方面进行了分析和预测。
　　(3)以含DEVNP基因的重组质粒pMD18-T-NP为模板，应用PCR方法扩增得到NP基因，克隆至原核表达载体pET-32a(＋)，构建重组表达载体pET-32a-NP，转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达研究。
　　(4)应用生物软件EMBOSS软件包的CHIPS和CUS程序对DEVNP基因的密码子使用情况进行分析，并与不同表达宿主如大肠杆菌、酵母和鸭等的密码子偏爱性进行比较。
　　[结果]：
　　(1)将扩增得到的克隆到pMD18-T载体后，经PCR鉴定可见一条与预期大小相一致(891bp)的DNA条带；采用BamHI与EcoRI进行双酶切后，可见2700bp大小的载体条带和890bp大小的目的条带；取阳性重组质粒进行测序，目的片段大小为891bp，其中含全长NP基因，为759bp，可编码252氨基酸。
　　(2)应用生物软件对DEVNP基因进行分析发现，该基因除了含一个完整的NP基因开放阅读框外，还含有4个开放阅读框；并含有1个保守结构域，为Herpes_UL5；与其他α-疱疹病毒相应序列具有较高的同源性；NP蛋白的主要抗原决定簇位于第8～19，104～112，165～170，194～208和237～245区段上；含有潜在的3个糖基化位点和14个磷酸化位点；为不含信号肽的膜外蛋白，亚细胞定位在细胞核上。
　　(3)通过双酶切取含NP基因的片段(891bp)克隆到原核表达载体pET-32a(＋)上，构建重组表达载体pET-32a-NP，经PCR、双酶切和测序鉴定后，取阳性重组质粒pET-32a-NP，转化至大肠杆菌BL21，采用不同浓度IPTG和不同诱导时间进行诱导表达，但均未见到相应的目的蛋白带，即DEVNP基因未能在大肠杆菌中得到表达。
　　(4)运用EMBOSS软件包CHIPS和CUSP程序进行分析显示，DEVNP基因的ENC值为51.180，编码NP蛋白的A、I等氨基酸不同密码子的使用频率存在一定的差异；从密码子使用频率比值上来看，大肠杆菌有22个、酵母有18个和鸭有12个密码子与DEVNP基因存在较大的密码子偏爱性。
　　[结论]：
　　(1)经序列测定及其同源性分析表明，鸭肠炎病毒NP基因具有典型的α-疱疹病毒特征，与α疱疹病毒同属于一类。
　　(2)经生物软件分析表明，鸭肠炎病毒NP蛋白含较多抗原结构域，可作为基因免疫研究的选择基因。
　　(3)经克隆表达研究和密码子偏爱性分析表明，鸭肠炎病毒NP基因更适于酵母菌等真核生物中表达。

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缩略语

文献综述

2 鸭肠炎病毒

实验研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 结论

致谢

参考文献

附录 一：攻读硕士学位期间参与发表的论文如下：

附录 二：氨基酸密码子表

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