两株猪细小病毒的分子特征及其主要蛋白的原核表达

摘要

猪细小病毒(porcineparvovirus，PPV)能够导致母猪的繁殖障碍，给世界各国养猪业带来了巨大的经济损失。目前，针对PPV主要结构蛋白VP2和非结构蛋白NS1的研究很多，但针对PPV全基因组的研究很少，GenBank中收录的完整的PPV全基因组序列只有两条(GenBankno.U44978和NC_001718)，因此，本论文对实验室分离的两株猪细小病毒(LXB-PPV-20-06和LXB-PPV-16-06)进行全基因组序列测定，以分析这两株猪细小病毒基因组的分子特征，并结合GenBank中收录的我国及国外的猪细小病毒序列，对猪细小病毒的遗传变异做一分析，并对LXB-PPV-20-06株主要的非结构蛋白NS1蛋白和结构蛋白VP2进行原核表达。 通过设计涵盖PPV全基因组的7对引物，分段克隆PPV的基因组片段，将PCR鉴定为阳性的重组质粒送大连宝生物工程公司测序。结果表明LXB-PPV-20-06株和LXB-PPV-16-06株基因组全长分别为5013nt和5031nt，其编码区均不存在碱基的插入与缺失，但在VP1/VP2终止密码子处的非编码区存在不同程度的碱基缺失，分别缺少63nt和45nt，推测可能与毒力变化有关。NS1基因及编码蛋白的多序列比对表明LXB-PPV-20-06株与美国Kresse株和我国的NJ株同源性最高，均为99.4％，PPV-16-06株与我国的SY-99株同源性最高。只有一个氨基酸位点的差异；VP2基因及编码蛋白的多序列比对表明PPV-20-06株与Kresse株同源性最高，其编码氨基酸序列完全一致，LXB-PPV-16-06株与LJL-12株同源性最高。根据VP2蛋白的多序列比对结果以及VP2蛋白215位、378位、383位、436位和565位氨基酸位点的变异情况，发现PPV感染的临床病理型与VP2蛋白这些位点的变异情况密切相关。遗传进化分析表明，我国的猪细小病毒流行毒株在进化树上比较接近。 通过PCR扩增LXB-PPV-20-06株NS1基因和VP2基因全序列，经酶切之后，克隆至pET-32a(+)载体上，经PCR、酶切鉴定，筛选重组表达质粒pET-NS1和pET-VP2，将阳性重组子送公司测序，经序列分析进一步验证重组子构建。将重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中，经总浓度为1mmol/LIPTG诱导，表达产物经SDS-PAGE分析，结果显示PPV-LXB-20-06株NS1基因和VP2基因均获得了良好的表达，用镍柱对融合蛋白进行纯化，融合表达的NS1蛋白的分子量接近97kDa，融合表达的VP2蛋白的分子量接近82kDa。Westernblot检测结果表明表达蛋白具有良好的抗原性，这为NS1蛋白和VP2蛋白在临床诊断中的应用奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录、英文缩略清单

声明

第一章 绪论

1.1 PPV简介

1.2 PPV分子生物学研究进展

1.3 PPV嗜性和宿主范围

1.4 PPV遗传变异研究进展

1.5本研究的目的与意义

第二章 两株猪细小病毒分离株的分子特征

2.1材料与方法

2.1.1毒 株

2.1.2豚鼠血红细胞制备

2.1.3试 剂

2.1.4主要仪器

2.1.5病毒分离

2.1.6病毒血凝活性检测

2.1.7免疫电镜观察

2.1.8 PPV基因组的分段克隆

2.1.9 PPV基因组序列分析

2.2结果

2.2.1病毒分离

2.2.2病毒血凝结果

2.2.3形态学观察

2.2.4 PPV基因组各片段的克隆、鉴定及序列测定

2.2.5 PPV基因组序列分析结果

2.3讨论

第三章 NS1基因和VP2基因的原核表达与纯化

3.1材料与方法

3.1.1质粒、细胞、病毒

3.1.2酶及主要试剂

3.1.3主要仪器

3.1.4 NS1基因和VP2基因重组表达载体的构建

3.1.5重组表达质粒的鉴定

3.1.6 NS1蛋白和VP2蛋白在大肠杆菌中的表达及鉴定

3.1.7 NS1融合蛋白和VP2融合蛋白的纯化

3.1.8纯化的NS1融合蛋白和VP2融合蛋白的复性

3.2结果

3.2.1 PCR扩增结果

3.2.2重组质粒的鉴定结果

3.2.3重组蛋白SDS-PAGE电泳

3.2.4重组蛋白的Western blot分析

3.2.5纯化情况

3.3讨论

第四章 全文结论

参考文献　

附 录

致 谢

作者简介及已发、待发主要论文、著作