马铃薯抗病同源序列系统进化分析及晚疫病抗病基因的克隆

摘要

马铃薯是仅次于水稻、小麦、玉米的世界第四大粮食作物，在国民经济中具有重要作用。马铃薯晚疫病是威胁马铃薯生产的主要病害之一，传统防治马铃薯晚疫病方法主要是采用抗菌剂及抗性育种策略。植物基因工程技术的不断完善和应用为马铃薯晚疫病的防治研究提供了新的契机，从马铃薯抗病资源中挖掘具有较高抗性的抗病基因，并将其导入到栽培品种中，无疑是我们获得和培育抗晚疫病马铃薯品系较为快捷的手段。本研究采用抗病基因同源序列法(即RGA法)，结合RACE技术克隆马铃薯晚疫病抗病基因，研究结果如下： (1)马铃薯抗病基因同源序列(RGAs)的分离和相似性分析以马铃薯抗晚疫病野生品种Solanumdimissum为试材，根据GenBank中已登录的植物抗病基因(R3a、R1、Rpi-blb1、Rpi-blb2，I2，I2C-1等)的NBS区的保守序列P-loop和GLPL区设计简并引物，以S.demissum的cDNA作模板进行RT-PCR扩增，共获得30条具有开放阅读框的含NBS区保守结构域的序列，利用生物信息学软件对所得序列进行同源性比较和系统进化分析，30条具开放阅读框的序列根据核酸相似性90％为界共分成9类，皆为马铃薯的抗病基因同源序列(RGAs)，且全部属于nonTIR-NBS-LRR类型。 (2)马铃薯晚疫病抗病基因候选基因的确定根据9类RGAs聚类分析结果分别设计特异引物，对S.demissum及六个对照栽培品种进行PCR和RT-PCR检测，结果表明：第Ⅳ(PB6-22)类仅在S.demissum中存在，第Ⅵ类(PB1-1)在S.demissum和大西洋中呈阳性，而其他类RGAs在所有的七个品种中都有扩增产物。初步确定第Ⅳ类和第Ⅵ类为马铃薯抗晚疫病相关的候选基因。 (3)晚疫病抗病基因的克隆利用RACE技术克隆出了第Ⅳ类(PB6-22)的基因，该基因命名为Sdpa，基因全长为3570bp，编码1189氨基酸，该基因含有抗病基因的NBS保守结构域(P-loop、Kinase2、Kinase-3a、GLPL等)，并在此基因中鉴定出了至少8个LRR结构域，其编码蛋白与已克隆的马铃薯晚疫病抗病蛋白R3a相似性达66.24％。基因表达及抗病性鉴定工作有待于进一步研究。

目录

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论文说明：英文缩略表

声明

第一章文献综述

1.植物抗病基因的研究进展

1.1 植物对病原菌的抗性类型

1.2 植物抗病性研究进展

1.3 R基因的序列保守性

1.4 R基因的分类

1.5 抗病基因同源序列(RGAs)研究进展

1.6 抗病基因的作用机理

1.7 信号的产生和传递

1.8 抗病基因的克隆策略

2 马铃薯晚疫病抗病基因的研究现状

2.1 已鉴定的Solanum demissum的晚疫病抗性基因

2.2 已鉴定的Solanum bulbocastanum的晚疫病抗病基因

2.3 来自于其他品种中的晚疫病抗病基因

3 本研究的目的意义和技术路线

第二章材料与方法

2.1材料

2.2方法

第三章结果与分析

3.1试验材料

3.2晚疫病抗病基因同源序列的克隆

3.3聚类分析

3.4九类RGAs在基因组水平的PCR鉴定

3.5九类RGAs在cDNA水平的鉴定

3.6 3'-RACE结果分析

3.7 5'-RACE结果分析

3.8 LA PCR扩增的PB6-22的5'端序列

3.9 PB6-22抗病基因全长的拼接

3.10讨论

第四章结论及创新点

参考文献

致 谢

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附 录