萝卜全基因组NBS--LRR抗病基因鉴定与NBS抗病基因同源序列克隆

摘要

萝卜(Raphanus sativus L.，2n=2x=18)，十字花科萝卜属一、二年生根菜类蔬菜，是广泛种植于中国的重要经济作物。萝卜在生长过程中易受各种病原菌侵袭而诱发病害，导致萝卜品质差，产量下降，进而造成重大经济损失。因此，选育萝卜抗病新品种成为控制病害发生的有效途径。近年来，随着全基因组测序工作的完善，利用全基因组序列进行抗病基因分离已成为抗性研究热点。研究表明，含有核苷酸结合位点(NBS)结构域的抗病基因为抗病基因家族中数量最多的一类，在抵御病原菌侵染方面起重要作用。然而，萝卜全基因组NBS-LRR类抗病基因的分离鉴定工作尚未见报道，而且萝卜NBS抗病基因同源序列分离工作仍有待进一步深入。本研究鉴定分析了萝卜全基因组中NBS-LRR类抗病候选基因序列，并对部分候选基因进行分离克隆。另外，利用NBS保守结构域设计简并引物，分离萝卜抗病基因同源序列，同时分析了部分克隆基因和同源序列的表达，本文主要研究结果如下: 1、萝卜全基因组中共鉴定到188个含NBS结构域的抗病候选基因，根据C端是否含TIR结构，可将188个基因分成128个TIR-NBS-LRR和60个non-TIR-NBS-LRR(CC-NBS-LRR)两大类。其中，74个RsNBS基因(39.36％)定位于萝卜连锁群R1-R9上。RsNBS基因在连锁群中分布相对分散，数量也各有不同。本研究中部分基因以基因簇形式存在，共鉴定到12个基因簇。R7上基因数最多（13个RsNBS基因），R6含有的基因簇最多（3个基因簇），R8所含基因簇中基因数最多（6个RsNBS基因）。 2、进化关系研究表明，萝卜NBS-LRR基因与拟南芥NBS类抗病基因具有较近的亲缘关系。基序和基因结构分析表明，188个萝卜抗病候选基因中均包含NBS保守结构域，并且包含保守基序(P-loop、RNBS-A、Kinase-2、RNBS-B和GLPL)和保守结构域(TIR、CC和LRR等)。基因结构分析发现，RsNBS基因含有平均外显子数为4.87。TNL类和CNL类RsNBS基因平均外显子个数分别为5.59和3.33个，而部分CNL类RsNBS基因(28.3％)由单个外显子编码而成。除RsNBS164外，其余TNL类RsNBS基因均由2个以上外显子构成。 3、利用简并引物进行PCR扩增，从萝卜中分离到50条具有完整开放阅读框的抗病基因同源序列(RGAs)，将其命名为RsRGA01-RSRGA50。聚类进化分析表明，50条同源序列分为TNL和CNL两类，分别含有14条和36条抗病基因同源序列，又可细分为RsRGAⅠ、RsRGAⅡ、RsRGAⅢ、RsRGAⅣ、RsRGAⅤ和RsRGAⅥ。序列比对和基序分析表明所有序列均含有P-loop、RNBS-B和kinase-2基序。其中，RsRGA31与拟南芥RPM1的相似性达89.77％，推测其可能与RPM1同源，且具有相似功能。对本研究中部分RsNBS基因进行DNA序列克隆，验证了数据库准确性。qRT-PCR分析结果表明，3个RsRGAs序列(RsRGA08、RsRGA34、RsRGA44)和4个RsNBS基因(RsNBS021、RsNBS044、RsNBS062、RsNBS164)在不同萝卜品种不同处理下呈现出差异表达模式，推测这些序列和基因在萝卜抗病防御信号途径中发挥重要作用。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章文献综述

2植物NBS-LRR抗病基因的结构、功能和进化机制

2．1植物NBS-LRR基因的结构和功能

2．2植物中NBS-LRR抗病基因的进化机制

3生物信息学在抗病基因鉴定中的应用

4本研究的目的与意义

第二章萝卜全基因组NBS-LRR抗病基因鉴定

1材料方法

1．2 NBS-LRR蛋白保守结构域和基序分析及蛋白序列特征预测

1．3序列比对和进化分析

1．4连锁群定位与基因簇分析

2结果与分析

2．1 NBS-LRR抗病候选基因鉴定

2．2 NBS类抗病候选基因进化分析

2．3 RsNBS基因结构分析与蛋白特征预测

2．4 RsNBS基因连锁群定位

3讨论

3．1 RsNBS抗病基因家族鉴定分析

3．2 RsNBS抗病基因家族进化机制

第三章萝卜NBS抗病基因同源序列克隆与表达分析

1材料方法

1．1材料

1．2 DNA提取和引物设计

1．3 PCR扩增

1．4总RNA提取与cDNA合成

1．5萝卜NBS-LRR基因和同源序列qRT-PCR分析

1．6 PCR产物回收与克隆

1．7序列分析、比对和系统发育树的构建

2结果与分析

2．1萝卜基因组中NBS类RGAs的分离

2．2萝卜RGAs序列比对分析与系统发育树构建

2．3萝卜RsRGAs与已知基因的相似性分析

2．4萝卜中NBS-LRR抗病基因克隆结果分析

2．5萝卜中RsRGAs的表达分析

3讨论

3．1萝卜中NBS类抗病基因同源序列分离

3．2 RsNBS基因克隆与表达分析

全文结论

参考文献

攻读硕士期间发表论文

致谢