牛腺病毒2型中国分离株的鉴定及全基因组序列分析

摘要

牛腺病毒3型(Bovine adenovirus3,BAV3),为腺病毒科(Adenoviridae)哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)的成员,属于牛腺病毒(Bovine adenovirus,BAV)第一群,能在已建立的牛细胞系中良好生长,且与其他哺乳动物腺病毒存在共同的补体结合抗原。BAV3是引起牛呼吸道疾病的主要病原体之一,特别是新生犊牛。临床上主要以肺炎等呼吸道症状为主,常伴发混合感染和继发感染,并能够引起新生仓鼠肿瘤。近年来,我国犊牛呼吸道肺炎频繁发生,给养牛业造成严重经济损失。自1965年Darbyshire等首次从健康牛结膜中分离获得BAV3以来,BAV3感染已在世界范围内广泛流行,目前我国还没有有关牛腺病毒3型的报道,更没有相关的诊断试剂和疫苗。
　　 本研究于2009年由患急性呼吸道病牛鼻拭子中分离获得一株病毒,该牛表现精神沉郁,呼吸困难,体温40℃以上,流鼻液等。将采集的牛鼻拭子处理后取上清液接种于MDBK细胞盲传至第二代出现了特征性的山脊状细胞病变；电镜下观察可见立体对称结构,大小约70nm的病毒粒子,与腺病毒相符；直接免疫荧光试验结果表明分离株与荧光标记的山羊抗BAV3多克隆抗体反应呈阳性。微量HA试验结果表明,该分离株能凝集牛红细胞,HA效价为1:64,而对小鼠、大鼠、豚鼠、鸡、马和绵羊的红细胞无凝集作用；病毒热敏感试验表明.50℃15min能够使分离株的TCID50值下降2.2个滴度,56℃30min则完全灭活,该分离株属于BAV第一群；根据已发表的BAV3全基因组序列,在E2A基因区设计特异性引物,以抽提的BAV3分离株DNA为模板进行PCR,扩增出长约644bp的目的片段。PCR产物克隆测序后,基于E2A基因的进化树分析表明分离株与BAV3属于同一分支,且对E2A基因编码产物DBP蛋白同源性比较分析显示,分离株与已报道的BAV3同源性最高,在98％以上,而与其它腺病毒的同源性较低。综合以上试验表明该分离株为BAV3,命名为BAV3 HLJ0955株。这是国内首次分离获得BAV3的报道。
　　 本研究参考GenBank上BAV3标准毒株WBR-1的全基因组序列设计了42对引物,对分离到的中国株HLJ0955进行全基因组测序,结果表明HLJ0955株基因组全长为34132bp,A+T含量为46.41％,G+C含量为53.59％。与WBR-1株全基因组进行比较分析,结果显示HLJ0955株在ITR区、E1B区和FA ORF1区有大段碱基缺失,但二者各段基因的核苷酸相似性较高,为92.7％-100％；各段基因编码的氨基酸相似性也较高,为87.2％-99.1％。基于腺病毒全基因组的进化树分析表明,HLJ0955株与BAV3 WBR-1标准毒株同源性最高,这进一步证明了HLJ0955株为BAV3。
　　 本研究对国内首次分离到的牛腺病毒3型HLJ0955株进行了鉴定和全基因组测序,对其生物学特性和分子特征进行了分析,为以后开展相关诊断试剂和新型载体疫苗研究奠定了良好的基础。