果聚糖合成酶基因在烟草和小麦中功能分析

摘要

果聚糖(fructan)是果糖基转移酶催化的由蔗糖与一个或多个果糖分子连接而成的水溶性和黏性的高分子多糖,具有多种生理功能和生物活性。干旱等逆境条件下,释放可溶性果糖,调节细胞渗透压,是参与植物抵抗渗透胁迫的重要物质之一。研究小麦中不同果聚糖合成酶基因Tal-SST、Ta6-SFT和Tal-FFT及其组合在植物抗逆性中的作用,为研究它们的作用机理提供更多分子生物学证据,为进一步利用基因工程手段改良小麦抗非生物胁迫能力提供理论依据。
　　 根据本实验室研究结果,从抗旱性较强的小麦品种扬麦6号扩增果聚糖合成酶基因Tal—SST,Tal-FFT,构建重组表达载体pBI121-Tal-SST和pZP211Tal-FFT；利用农杆菌介导法将pBI121—Tal-SST、pZP211-Tal-FFT和前期构建的pBI121-Ta6-SFT植物表达载体共转化野生型烟草NC89,对抗性再生植株进行PCR、ELISA检测、抗逆鉴定及生理指标测定。结果表明,共转化小麦果聚糖合成酶基因的阳性植株抵抗逆境胁迫能力明显提高。干旱、低温、高盐等逆境胁迫研究发现,阳性植株抗逆性有较大提高；生理指标测定结果分析发现,阳性植株含量优于野生型,且转多基因阳性植株各项指标测定结果优于转单基因阳性植株。在阳性植株生理指标测定结果中,果聚糖含量较高者为转Tal-SST+Ta6-SFT基因(675.6 mg g-1)和转Tal—SST+Tal—FFT+Ta6-SFT基因(140.7 mg g-1)植株；转Tal-SST+Ta6-SFT基因和转Tal-SST+Tal—FFT+Ta6-SFT基因植株脯氨酸含量分别为184.4μg g-1和201μg g-1；转Tal—SST+Ta6-SFT基因植株丙二醛含量为12.9μmol mg-1FW,转Tal-SST+Tal—FIT+Ta6-SFT基因植株为14.9μmol mg-1FW；可溶性糖含最最高为转Tal-SST+Ta6-SFT基因植株(0.262％),其次为转Tal-SST+Tal-FFT+Ta6-SFT基因植株(0.234％)。综合上述结果可知,Tal-SST+Ta6-SFT基因为最优组合,抗逆功能最强。
　　 以农杆菌介导法将果聚糖合成酶基因RNA干扰载体pANDA-Tal—FFT-RNAi转入小麦幼胚和成熟胚愈伤组织获得候选转基因植株,同时对转Tal-SST-RNAi基因、转Ta6-SFT-RNAi基因沉默片断的T1代植株进行PCR、荧光定量PCR检测。结果表明,筛选标记基因nptⅡ在转基因小麦中能够检测到；荧光定量PCR检测分析发现,转基因植株中目的基因表达量低于受体材料,基因沉默效果明显,其中基因相对表达量最低者仅为阴性对照基因表达量的0.11；通过基因枪介导法将果聚糖合成酶基因过表达载体pRTL2-Tal-SST、pRTL2-Tal-FFT分别转入小麦幼胚愈伤组织获得候选转基因植株,并对过表达载体pRTL2-Ta6-SFT的T1代植株进行了PCR检测。结果发现,通过bar基因初次筛选和目的基因二次筛选,目的基因已成功转入小麦。
　　 同时,本研究还优化了小麦组织培养体系,为进一步提高小麦再生效率和遗传转化效率奠定了基础。通过系统比较植物激素对小麦幼胚再生效果的影响,明确了dicamba、2,4,5-T、picloram最适浓度分别为2.5 mg L-1、3.0 mg L-1和3.0 mg L-1,在添加2.0 mg L-12,4-D诱导培养基中额外添加0.3 mg L-1 ABA能显著改进愈伤组织质量,提高绿苗诱导率。此外,诱导培养基中添加0.1～4.1μmol L-1 CuSO4对CB037成熟胚培养效果无显著差异,当浓度达6.1μmol L-1时植株再生率降低极显著；Fe盐浓度50μmol L-1～60μmol L-1有利于CB037成熟胚愈伤组织再生植株,40μmol L-1处理显著提高CB037幼胚愈伤组织分化,新春9号和Bobwhite幼胚培养适宜Fe盐浓度为20μmol L-1。