滑液支原体膜表面丙酮酸脱羧酶的生物学特性研究

摘要

滑液支原体（Mycoplasma synoviae，MS）是严重危害养禽业的一种重要的病原微生物，其在世界各地的养鸡场中均有分布，给养禽产业带来了严重威胁。近年来的流行病学调查资料表明，滑液支原体感染呈扩大和蔓延之势，其危害亦日显严重，甚至可能会超过鸡毒支原体而成为危害养禽业头号支原体病。滑液支原体主要引起鸡和火鸡的呼吸道感染及关节炎，而蛋鸡输卵管的损伤亦被证实与滑液支原体有关。不同的毒力株滑液支原体的感染性、组织嗜性和致病性有所不同。因此，滑液支原体感染后可有不同的临床表现。虽然滑液支原体的感染极少直接造成禽类的死亡，但其导致的生长迟滞，蛋壳畸形，死淘率上升、肉鸡胴体废弃率增加以及防控所需的大量投入，均可造成严重的经济损失。而且，滑液支原体的感染可导致新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、大肠杆菌及金黄色葡萄球菌等病原微生物的混合或继发感染，从而使损失加剧。
　　目前，由于尚无有效的疫苗可供使用，滑液支原体感染的防控主要通过加强生产管理，改善饲养条件和合理应用抗生素等措施，但亦很难对该病完全控制和彻底清除。因此，开展滑液支原体相关的研究，必将为滑液支原体感染的有效预防和控制奠定理论基础。基于此，本研究开展了如下的研究工作:
　　1)应用双向电泳技术对滑液支原体WUV1853株膜蛋白进行了分离，进而通过Western blot对膜蛋白中具有免疫原性的蛋白进行了筛选并应用质谱分析的方法进行鉴定。结果表明，所筛选的免疫原性膜蛋白分别是丙酮酸脱羧酶α亚基和β亚基、二氢硫辛酸脱氢酶PDHD、转录延伸因子EF-Tu以及NADH氧化酶，其中丙酮酸脱羧酶α亚基和β亚基属首次报道。
　　2)为了更有效直观的研究滑液支原体膜蛋白对宿主细胞的粘附功能，以截短的冰核蛋白InaZ基因的N-端结构域为锚定基序，构建了用于支原体粘附相关蛋白鉴定的表面展示系统，并以鸡毒支原体黏附素Mge2作为模型蛋白对该系统的展示功能进行了验证。SDS-PAGE及Western blot结果显示，融合的外源蛋白能被成功锚定到大肠杆菌的细胞外膜。免疫荧光显微镜和全菌ELISA结果亦证实融合的外源蛋白被展示在大肠杆菌细胞的表面。表面展示有mgc2的大肠杆菌对宿主细胞的粘附试验结果表明:表面展示有mgc2黏附素的大肠杆菌细胞可以粘附到DF-1细胞的表面，且这种粘附可被特异的抗体抑制。因此，研究构建的大肠杆菌表面展示系统可用于支原体粘附蛋白的鉴定。
　　3)参照GenBank中滑液支原体P53株的丙酮酸脱羧酶α亚基基因序列设计引物，通过PCR扩增获得滑液支原体WVU1853株丙酮酸脱羧酶α亚基并将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)，测序并经点突变完成密码子优化后，表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达后的产物PDCA纯化后免疫家兔制备多抗。在此基础上，完成了丙酮酸脱羧酶α亚基在滑液支原体内的亚细胞定位、α亚基原核表达产物与纤维蛋白溶酶原(Plasminogen，Plg)和纤连蛋白(Finectin，Fn)的体外结合试验、α亚基兔多抗介导的补体杀菌试验及α亚基兔多抗对滑液支原体粘附宿主细胞的抑制试验。结果表明:丙酮酸脱羧酶α亚基在滑液支原体细胞膜和细胞质中均有分布，其原核表达产物具有Plg和Fn结合活性，且PDCA兔多抗能有效激活补体并能抑制滑液支原体对宿主细胞DF-1的黏附作用。
　　4)参照GenBank中滑液支原体P53株丙酮酸脱羧酶β亚基基因序列设计引物，对滑液支原体WVU1853株丙酮酸脱羧酶β亚基基因pdcB进行了扩增，并构建其原核表达载体进而在大肠杆菌中成功表达。表达产物His-PDCB纯化后免疫家兔制备多抗，并以此为基础，分别对PDCB在滑液支原体内的分布、其与Plg和Fn的结合活性、对宿主细胞的粘附性能进行了分析和研究，也对His-PDCB兔多抗介导的补体杀菌试验和rHIS-PDCB兔多抗抑制滑液支原体粘附宿主细胞的作用进行了比较研究。结果表明: PDCB在滑液支原体细胞膜和细胞质中均有分布，其原核表达产物His-PDCB具有结合Plg和Fn的活性，而且His-PDCB兔多抗具有明显的介导补体杀菌作用及抑制滑液支原体对DF-1细胞粘附的作用。
　　5)以构建的表达质粒pET-pdcA和pET-pdcB为模板，设计引物，通过PCR和overlap-PCR扩增出pdcA基因(A)、pdcB基因(B)及两者的自然结构连接A+B，并分别克隆入pETduet-1和pET-28a(+)，构建原核共表达载体pETDuet-AB和pET-AB。共表达载体转化大肠杆菌表达菌BL21(DE3)，经1mM的IPTG在16℃，200rpm条件下诱导10h。SDS-PAGE和western blot分析结果表明，两种表达载体转化的表达菌均获得可溶性表达PDCA和PDCB。表达产物纯化后酶活性分析表明，两种载体表达的产物均具有酶活性且活性基本相同。因此，研究结果为滑液支原体丙酮酸脱羧酶酶活性及其他生物学特性的研究奠定了基础，也可能会为蛋白质不同亚基的共表达探索出一种新方法。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 绪论

1．1 支原体及滑液支原体

1．1．1 支原体

1．1．2 滑液支原体

1．2 蛋白质组学及其研究内容、技术和在兽医研究中的应用

1．2．1 蛋白质组学研究的内容

1．2．2 蛋白质组学研究技术

1．2．3 蛋白质组学在兽医研究中的应用

1．3 滑液支原体蛋白质组学研究

1．4 本研究的目的和意义

第二章 滑液支原体WUV1853株主要免疫相关膜蛋白的鉴定

2．1 材料与方法

2．1．1 菌株和培养条件

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 培养基，主要缓冲液及试剂的配制

2．1．5 滑液支原体的培养

2．1．6 WVU1853株兔多抗及鸡多抗的制备

2．1．7 制备膜蛋白

2．1．8 蛋白质的双向电泳

2．1．9 免疫印迹

2．1．10 质谱分析

2．2 结果

2．2．1 MS WVU1853株膜蛋白及亲水蛋白的SDS-PAGE结果

2．2．2 MS WVU1853株膜蛋白的Western blot结果

2．2．3 质谱结果及数据分析

2．3 讨论

第三章 基于冰核蛋白N-端结构域的大肠杆菌表面展示载体的构建及在支原体粘附蛋白鉴定中的应用

3．1 材料和方法

3．1．1 菌种和质粒

3．1．2 细胞系

3．1．3 化学试剂、酶及抗体

3．1．4 主要仪器

3．1．5 培养基，主要缓冲液及试剂的配制

3．1．6 鸡毒支原体的培养

3．1．7 鸡毒支原体基因组的粗提

3．1．8 细胞培养

3．1．9 截短的冰核蛋白N-末端DNA序列的合成及质粒构建

3．1．10 融合蛋白的表达

3．1．11 EGFP荧光检测

3．1．12 大肠杆菌细胞的分级分离

3．1．13 SDS-PAGE及Western blot分析

3．1．14 免疫荧光显微镜观察

3．1．15 全菌的ELISA检测

3．1．16 InaZN-EGFP-Mgc2阳性表达菌对宿主细胞的粘附试验

3．2 结果

3．2．1 细胞膜表面展示载体的构建

3．2．2 融合蛋白InaZ-N／EGFP及InaZ-N／EGFP／Mgc2的表达

3．2．3 融合蛋白的定位

3．2．4 重组的融合蛋白在细胞表面的展示

3．2．5．表面展示Mgc2的大肠杆菌对DF-1细胞的粘附

3．3 讨论

第四章 滑液支原体丙酮酸脱羧酶α亚基生物学特性研究

4．1 材料和方法

4．1．1 菌种、载体

4．1．2 抗体及实验动物

4．1．3 主要试剂

4．1．4 主要仪器

4．1．5 培养基、主要缓冲液及试剂配制

4．1．6 MS基因组的提取

4．1．7 pdcA基因的克隆及载体的构建

4．1．8 pdcA基因的原核表达及蛋白纯化

4．1．9 PDCA兔多抗的制备

4．1．10 PDCA在MS细胞内的分布分析

4．1．11 PDCA与Plg和Fn结合试验

4．1．12 PDCA多抗介导的补体杀菌实验

4．1．13 粘附及其粘附抑制实验

4．1．14 PDCA+E．coli DF-1细胞的粘附及其粘附抑制实验

4．2 结果

4．2．1 pdcA基因的克隆

4．2．2 pdcA基因的表达

4．2．3 pdcA基因表达产物的纯化

4．2．4 PDCA兔多抗效价的检测

4．2．5 PDCA在细胞内的分布

4．2．6 PDCA与纤溶酶原(Plg)和纤连蛋白(Fn)的结合活性

4．2．7 PDCA多抗血清的体外杀菌实验

4．2．8 PDCA抗血清的粘附抑制实验

4．2．9 PDCA+E．coliDF-1细胞的粘附及其粘附抑制实验

4．3 讨论

第五章 滑液支原体丙酮酸脱羧酶β亚基生物学特性研究

5．1 材料和方法

5．1．1 菌种、载体

5．1．2 抗体及及实验动物

5．1．3 主要试剂

5．1．4 主要仪器

5．1．5 主要缓冲液及试剂配制

5．1．6 MS基因组的提取

5．1．7 pdcB基因的克隆及载体的构建

5．1．8 pdcB基因的原核表达

5．1．9 重组蛋白的纯化

5．1．10 PDCB兔多抗的制备

5．1．11 PDCB在MS细胞内的分布

5．1．12 PDCB与Plg和Fn结合试验

5．1．13 His-PDCB多抗介导的补体杀菌实验

5．1．14 粘附及其粘附抑制实验

5．1．15 PDCB+E．coli对DF-1细胞的粘附及其粘附抑制实验

5．2 结果

5．2．1 pdcB基因的克隆

5．2．2 pdcB基因的表达

5．2．3 pdcB基因表达产物的纯化

5．2．4 His-PDCB兔多抗效价的检测

5．2．5 PDCB在细胞内的分布

5．2．6 纤溶酶原(Plg)及纤连蛋白(Fn)与His-PDCB的结合活性

5．2．7 His-PDCB抗血清的体外杀菌实验

5．2．8 PDCB抗血清的粘附抑制实验

5．2．9 PDCB+E．coli DF-1细胞的粘附及其粘附抑制实验

5．3 讨论

第六章 MS WVU1853株pdcA／pdcB基因共表达质粒的构建及原核表达

6．1 材料和方法

6．1．1 菌种、载体

6．1．2 抗体

6．1．3 主要试剂

6．1．4 主要仪器

6．1．5 主要缓冲液及试剂配制

6．1．6 共表达载体的构建

6．1．7 pdcA及pdcB基因的原核共表达

6．1．8 共表达蛋白的纯化

6．1．9 共表达产物酶活性测定

6．1．10 pET-AB表达纯化产物的酶促米氏常数

6．2 结果

6．2．1 pdcB基因的克隆

6．2．2 pdcA及pdcB基因的共表达

6．2．3 pdcB基因表达产物的纯化

6．2．4 共表达产物酶活性测定

6．2．5 pET-AB表达纯化产物的酶促米氏常数

6．3 讨论

第七章 全文结论

参考文献

致谢

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