牦牛肉品质性状候选蛋白的筛选与鉴定

摘要

牦牛主要分布在青藏高原及其毗邻的高山和亚高山地区，是当地牧民主要的肉食来源。传统的饲养方式和特殊的生活环境使其形成了独特的肉品质。牦牛肉品质形成的分子机制目前仍不明确。为了更好地解析牦牛肉品质形成的遗传调控机制，本研究以成年牦牛和黄牛的背最长肌为研究对象，利用荧光定量PCR(Q-PCR)、气象色谱-质谱联用(GC-TOF-MS)、同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)等方法分析了牦牛和黄牛肌肉中肌纤维组成、代谢物和蛋白质的差异，为传统放牧模式下牦牛肉品质的选育和牦牛分子育种提供科学依据和理论支撑。
　　1.与黄牛肉相比，牦牛肉的PH45mm、a*值和系水力较高，肌内脂肪含量较少且嫩度较低。通过分析背最长肌中不同肌纤维类型分子标记(MyHCⅠ、MyHCⅡA、MyHCⅡX和MyHCⅡB)的表达量，发现牦牛背最长肌中Ⅰ型肌纤维（慢速氧化型）的含量显著高于黄牛(P＜0.05)，而ⅡA型（快速氧化型）和ⅡB型肌纤维（快速酵解型）含量显著低于黄牛(P＜0.05)。Pearson相关性分析发现，牦牛和黄牛MyHCⅠmRNA的表达量与PH45min值、a*和系水力呈正相关，与L*值呈显著负相关，MyHCⅡBmRNA的表达量与a*值呈显著负相关，与L*值呈显著正相关，MyHCⅡA mRNA的表达量与肌内脂肪含量呈显著负相关。说明肌纤维组成是影响牦牛和黄牛肉品质的重要因素。
　　2.利用GC-TOF-MS技术检测了牦牛和黄牛背最长肌中的代谢标志物。共筛选到17种浓度有显著差异的代谢物，其中葡萄糖-6-磷酸、2-羟丁酸、肉豆蔻酸、亚麻酸、油酸、甘露糖基甘油酸、麦芽糖、尿苷、果糖、天冬氨酸和戊二酸在牦牛背最长肌中浓度上调，黄嘌呤核、洋地黄毒糖、葡糖酸、烟酸、核糖酸，γ内酯和谷氨酸在黄牛背最长肌中浓度上调。牦牛背最长肌中浓度上调的代谢物显著富集在糖酵解和不饱和脂肪酸合成的代谢通路中，黄牛背最长肌中浓度上调的代谢物显著富集在嘌呤代谢和烟酸与烟酰胺代谢通路中。相关性分析表明牦牛背最长肌中葡萄糖-6-磷酸的含量与PH45min呈显著正相关，黄牛背最长肌中烟酸含量与肌内脂肪含量呈显著正相关。这些结果表明，牦牛和黄牛背最长肌中的碳水化合物和脂类的代谢强度不同，葡萄糖-6-磷酸可作为牦牛肉PH45min的候选代谢标志物。
　　3.利用iTRAQ和双向电泳技术筛选了牦牛和黄牛背最长肌中的差异蛋白质。在牦牛和黄牛背最长肌中鉴定到458种蛋白质，大部分蛋白质等电点在4-10之间，极酸性和极碱性蛋白很少。在牦牛背最长肌中表达量上调的蛋白有57种，显著富集在三羧酸循环、脂肪酸代谢、氧化磷酸化等通路中，在黄牛背最长肌中表达量上调的蛋白有46种，显著富集在糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢等通路中。通过相关性分析筛选到12种与牦牛肉品质性状相关的蛋白，其中CAPN1、LDHB、IDH2、HSPB6、CRYAB、SOD1和HADH与嫩度显著相关，PGM1和ATP5A1与PH45min显著相关，NDUFS2、MDH1和SOD1与肌内脂肪含量显著相关，HBA与肉a*值显著相关。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 畜禽肌纤维类型与肉品质

1．1．1 肌纤维类型的分类

1．1．2 不同类型肌纤维的特征

1．1．3 肌纤维类型对肉品质的影响

1．2 蛋白质组学的发展及其在畜禽肉品质研究中的应用

1．2．1 蛋白质组学概述

1．2．2 蛋白质组学的研究技术

1．2．3 蛋白质组学在肉品质研究中的应用

1．3 代谢组学的发展及其在动物科学研究中的应用

1．3．1 代谢组学概述

1．3．2 代谢组学的研究技术

1．3．3 代谢组学在动物科学中的应用

1．4 本研究的目的和意义

第二章 牦牛和黄牛背最长肌肉品质比较和肌纤维组成差异研究

2．1 试验材料

2．1．1 试验动物和样品采集

2．1．2 主要仪器

2．1．2 主要试剂

2．2 方法

2．2．1 性状测定

2．2．2 MyHC mRNA表达量测定

2．2．3 MyHC蛋白含量测定

2．3 结果与分析

2．3．1 牦牛与黄牛的胴体性状和肉品质性状比较

2．3．2 牦牛与黄牛背最长肌MyHC mRNA含量与组成比例

2．3．3 牦牛与黄牛背最长肌MyHC蛋白含量与组成比例

2．3．4 MyHC各亚基mRNA和蛋白质表达量的相关性

2．3．5 肌肉纤维类型组成与肉质性状的相关性分析

2．4 讨论

2．4．1 牦牛背最长肌肌纤维组成

2．4．2 MyHC表达量用于分析肌纤维类型的研究

2．4．3 肌纤维类型与肉品质的关系

2．5 小结

第三章 牦牛和黄牛背最长肌组织中差异代谢组学研究

3．1 试验材料

3．1．1 实验动物和样品采集

3．1．2 主要仪器

3．1．3 主要试剂

3．2 方法

3．2．1 代谢物萃取

3．2．2 代谢物衍生化

3．2．3 上机检测

3．2．4 数据处理与分析

3．3 结果与分析

3．3．1 牦牛和黄牛背最长肌代谢物总离子流图

3．3．2 主成分分析(PCA)

3．3．3 偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)及对模型的验证

3．3．4 正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)及对模型的验证

3．3．5 差异代谢物的筛选及鉴定

3．3．6 差异代谢物的KEGG

3．3．7 差异代谢物与肉品质的相关性分析

3．4 讨论

3．4．1 GC-MS技术的分辨率

3．4．2 差异代谢物与肉品质的关系

3．5 小结

第四章 牦牛和黄牛背最长肌比较蛋白质组学研究

4．1 试验材料

4．2 方法

4．2．1 蛋白质提取和和浓度测定

4．2．2 iTRAQ标记

4．2．3 双向电泳(2-DE)分析

4．2．4 生物信息分析

4．2．5 差异蛋白对应基因的mRNA表达量分析

4．2．6 差异蛋白的westem blotting验证

4．3 结果与分析

4．3．1 肌肉中总蛋白的鉴定信息

4．3．2 iTRAQ结果分析

4．3．3 蛋白质双向电泳结果分析

4．3．4 iTRAQ和2-DE结果的比较

4．3．5 差异蛋白的GO功能注释和分类

4．3．6 差异蛋白的pathway富集分析

4．3．7 差异蛋自在mRNA水平的验证

4．3．8 差异蛋白的Western blotting验证

4．3．9 差异蛋白与肉品质性状的相关性分析

4．4 讨论

4．4．1 肌肉蛋白质提取

4．4．2 iTRAQ鉴定能力

4．4．3 牦牛肌肉中蛋白质的特征

4．4．4 双向电泳和iTRAQ的比较

4．4．5 差异蛋白与肉品质的关系

4．5 小结

第五章 全文结论

5．1 全文总结

5．2 创新点

参考文献

附录

致谢

作者简历