牦牛角性状候选基因与蛋白的筛选和鉴定

摘要

牦牛是我国西部高寒高海拔地区特有的、重要的牛种，主要分布于海拔3，000米以上的青藏高原及其毗邻高山、亚高山地区，为牧民提供食物、役力、燃料及其他生活、生产资源。牛角是牛科动物特有的外部属性，是争夺配偶、自我防卫的武器。随着传统牦牛放牧饲养向现代半舍饲、全舍饲养殖模式的转变，无角牦牛“占地空间小，便于饲养管理”等特点越来越受牧民喜爱;另外，牛角不仅给饲养员带来安全隐患，而且牛只在相互顶撞过程中受伤，严重影响经济效益。因此，在现代牦牛养殖业中，无角牦牛的需求量逐渐增大。本论文从分子遗传学角度研究牦牛角的产生和遗传机理，为培育无角牦牛提供理论依据。
　　1.基于全基因组关联分析研究结果，本研究采用目标区段捕获测序技术(Targetedresequencing)对牦牛1号染色体207 kb的候选区段(Reference∶ Bos mutus;scaffold526_1∶1，116，000-1，323，000)进行分析，共检测到2，617个SNPs和330个Indels。其中有39个同义突变，14个错义突变，和1个INDEL位于编码区内;有3个基因（SYNJ1、GCFC1和C1H21 orf62）位于目标区域内。相关分析筛选出1，076个显著关联SNPs(P＜0.05)，其中31个SNPs在有角组和无角组中与表型共分离。C1H21orf62基因编码区内存在g.1235483G＞A和g.1235468G＞A两个错义突变，分别导致氨基酸由甲硫氨酸(MeT)和异亮氨酸(Ile)改变为缬氨酸(Val);且变异位点只在无角牦牛组中出现（30个样品中，有27个样品为错义突变）。
　　2.采用PCR扩增结合Sanger测序技术，选取398份有角牦牛和369份无角牦牛血液基因组DNA，对SNP g.1235483G＞A和g.1235468G＞A位点进行验证。结果发现这两个SNP完全连锁，有角牦牛97.2％为纯合型(GG-GG)，2.8％为杂合型(GA-GA);无角牦牛中，82.7％为杂合型(GA-GA)，只有3％个体为AA-AA纯合型，然而存在14.3％的GG-GG基因型个体。表明这两个位点不是牦牛无角性状的因果突变。我们也不能排除显著关联SNPs位点对无角表型可能的等位基因异质作用。
　　3.采用qPCR技术对有角胎牛和无角胎牛角原基、前额部皮肤、无角额部皮肤、心、肝、脾、肺及肾组织进行候选基因SYNJ1、GCFC1和C1H21orf62表达谱测定，结果表明SYNJ1在所有组织中均表达，特别是心、肝和脾中表达量较高;GCFC1在所有组织中表达量均较低，且表达水平基本一致;C1H21orf62基因在肝中表达量极高，其次为角原基及前额部组织;然而3个基因在角原基、前额部皮肤及无角额部组织间表达均无显著性差异。
　　4.采用iTRAQ技术对有角胎牛角原基和无角胎牛对应的额部皮肤组织进行蛋白质组比对研究，共检测到5，253个可信蛋白。无角组比对有角组筛选出差异表达蛋白100个。其中上调蛋白29个，大部分与代谢活动相关;下调蛋白71个，主要参与细胞发育和细胞结构组成。生物信息学分析发现一些重要的蛋白质与细胞粘附、细胞运动、角质细胞分化、成骨细胞分化及脂肪酸代谢相关，推测这些生物学过程可能是角原基发育过程所必需。组织形态学研究发现胎牛角原基表皮层有多层空腔角质细胞，结合免疫荧光试验检测到FABP5在表皮层空腔角质细胞中高表达，推测该蛋白与表皮层细胞角质化有关，为进一步挖掘牦牛角形成机理提供理论基础。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 无角牛育种史

1．2 牛角性状的研究现状

1．2．1 牛角的遗传机制

1．2．2 无角变异位点的筛选

1．2．3 残角变异位点的筛选

1．2．4 差异表达基因的筛选

1．2．5 胎牛角原基发生的形态学研究

1．3 牦牛角性状的研究现状

1．3．1 牦牛角的遗传机制

1．3．2 无角变异位点的筛选

1．3．3 差异表达基因的筛选

1．3．4 牦牛角原基发生的形态学研究

1．4 绵、山羊角性状的研究现状

1．5 目标区段捕获测序技术

1．6 iTRAQ技术

1．7 本研究目的和意义

第二章 目标区段捕获测序研究

2．1 材料与方法

2．1．1 样品采集

2．1．2 主要仪器

2．1．3 主要试剂和耗材

2．1．4 试验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 目标区域捕获测序结果

2．2．2 Sanger测序验证结果

2．2．3 内参筛选结果

2．2．4 qPCR分析结果

2．3 讨论

2．3．1 SYNJ1、GCFC1和C1H21orf62基因研究概述

2．3．2 牦牛无角位点筛选

2．3．3 内参基因稳定性评估

2．3．4 SYNJ1、GCFC1和C1H21orf62基因表达量分析

2．4 本章小结

第三章 蛋白质组学研究

3．1 材料与方法

3．1．1 样品采集

3．1．2 主要仪器

3．1．3 主要试剂和耗材

3．1．4 试验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 胎牦牛角基组织切片结果

3．2．2 差异表达蛋白的鉴定

3．2．3 蛋白分类

3．2．4 GO分类

3．2．5 差异蛋白的Pathway膏集分析

3．2．6 蛋白互作分析

3．2．7 qPCR分析结果

3．2．8 免疫荧光结果

3．2．9 Western blot验证结果

3．3 讨论

3．3．1 胎牦牛角原基的形态学特征

3．3．2 差异表达蛋白的生物信息学分析

3．3．3 与细胞粘附相关的差异表达蛋白

3．3．4 与角质细胞分化相关的差异表达蛋白

3．3．5 与细胞运动相关的差异表达蛋白

3．3．6 与成骨细胞分化相关的差异表达蛋白

3．3．7 与脂肪酸代谢相关的差异表达蛋白

2．4 本章小结

第四章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历