流产衣原体MIP蛋白的双抗原夹心ELISA诊断方法建立及单克隆抗体制备

摘要

流产衣原体（Chlamydia abortus，C.abortus）是一种严格细胞内寄生的革兰氏阴性细菌，可感染妊娠母畜导致流产、死产或者弱胎等;也可引起公畜发生睾丸炎、尿道炎等症状;孕妇与感染的动物直接接触也会造成流产及全身感染等症状，因此流产衣原体是一种重要的人兽共患病病原。巨噬细胞感染增强蛋白(MacropHage Infectivity Potentiator，MIP)是一种脂蛋白，作为一种免疫显性抗原，参与衣原体感染，引起炎症反应等过程。
　　本研究以MIP为研究对象，利用GenBank已公布的序列，设计引物，PCR扩增得到MIP蛋白的编码基因，经过酶切、连接、转化将其插入原核表达载体pET30a(+)，成功构建表达载体pET-mip并转化入E.coli BL21(DE3)中诱导表达，经SDS-PAGE分析可见在27 kD处出现特异性条带，表明插入的mip基因成功表达;Western-blot特异性实验验证表达的MIP蛋白具有反应原性。
　　以纯化的MIP蛋白做为包被抗原，HRP标记的MIP蛋白为酶标抗原，最适包被浓度为2.5μg/mL，血清最佳稀释度为1∶100，建立双抗原夹心ELISA方法。建立的双抗原ELISA与IHA相比，敏感性高，符合率为89.3％;与支原体、嗜肺军团菌、口蹄疫等阳性血清无交叉反应;批间、批内CV％均小于11％，表明建立的双抗原夹心ELISA方法特异性强、灵敏度高、重复性好。
　　以纯化的MIP蛋白免疫Balb/c小鼠后筛选阳性细胞克隆并进行有限稀释克隆化，建立了两株能稳定分泌抗MIP蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为M1和M3。间接ELISA法鉴定单抗上清抗体效价为1∶1600;染色体鉴定符合杂交瘤细胞的特性;两株单抗50％最大结合浓度均为10μg/mL; Western-blot鉴定两株单克隆抗体能特异识别MIP蛋白;Mouse单克隆抗体亚类检测试剂盒鉴定2株单抗免疫球蛋白类型均为IgG1，轻链为κ链;鸡胚接种鉴定2株单抗能有效中和衣原体感染性。
　　综上所述，本研究成功表达了流产衣原体MIP蛋白，建立了MIP蛋白双抗原夹心ELISA诊断方法，制备了抗MIP单克隆抗体，为流产衣原体的准确诊断及相关致病机制的研究和奠定了基础。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 衣原体概述

1．2 衣原体的诊断研究进展

1．2．1 病原学诊断

1．2．2 衣原体血清学诊断方法

1．3 MIP蛋白的研究进展

1．4 本研究目的和意义

第二章 流产衣原体mip基因的克隆与表达

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 材料

2．2．2 方法

2．3 结果与分析

2．3．1 mip目的基因的扩增结果

2．3．2 pMD18-T simple-mip重组克隆质粒的鉴定

2．3．3 重组表达质粒pET-mip的鉴定

2．3．4 诱导表达的MIP蛋白的SDS-PAGE分析

2．3．5 表达MIP蛋白Western-blot鉴定

2．3．6 表达蛋白MIP的大量诱导纯化

2．4 讨论

第三章 流产衣原体MIP蛋白双抗原夹心ELISA诊断方法的建立

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 材料

3．2．2 方法

3．3 结果与分析

3．3．1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定

3．3．2 最佳包被条件的确定

3．3．3 最佳封闭液及封闭时间的确定

3．3．4 酶标抗原最佳稀释度及孵育时间的确定

3．3．5 血清最佳作用时间的确定

3．3．6 底物缓冲液最佳作用时间的确定

3．3．7 双抗原夹心ELISA诊断方法临界值的确定

3．3．8 特异性试验

3．3．9 敏感性试验

3．3．10 重复性试验

3．3．11 符合率试验

3．3．12 稳定性试验

3．4 讨论

第四章 抗MIP蛋白单克隆抗体的制备

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 材料

4．2．2 方法

4．3 结果与分析

4．3．1 杂交瘤细胞株的建立

4．3．2 单克隆抗体效价及亚类鉴定

4．3．3 单克隆抗体相对亲和力鉴定

4．3．4 抗体特异性鉴定

4．3．5 杂交瘤细胞系染色体分析

4．3．6 杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体稳定性试验

4．3．7 流产衣原体中和试验

4．4 讨论

第五章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简介