饲料、血液及尿液中多族药物LC-MS/MS检测方法的建立和验证

摘要

动物使用的饲料会对人类的公共健康产生重要的影响。动物性饲料管理规定如药品一样，远比食用性产品的管理规定要严格，并且饲料在上市前需要进行安全性和有效性的检测考察。对于饲料的关注不仅仅是因为使用它喂养动物，而且还是为了弥补确保饲料和食物供应安全的管理规定和系统的漏洞。尽管了解了动物饲料对于公众健康的重要性，然而是否需要将饲料管理制定成类似药品管理那样，还取决于该饲料的实际使用程度。本方法旨在同时筛查、确证和定量饲料中的更多的不同极性和解离程度的兽药。本方法使用D-SED联合超声提取，利用LC-MS/MS对多种目标基质进行检测。方法关注的是饲料中动物源性食品自身的以及允许使用和禁止使用的药品添加剂。该方法基于高选择性和高灵敏性的LC-MS/MS，建立了饲料、尿液、血清和血浆这四种基质中的分析方法。本方法实现了对于25个不同类别共200种禁止在饲料添加剂使用的兽药进行同时检测定量和确证，包括，β-内酰胺类，β-激动剂，β-阻断剂，磺胺类，非甾体抗炎药类，类固醇，喹诺酮类，诺酮类，大环内脂类，抗球虫药，哌啶类，胺类，青霉素类，糖苷类，氨基糖苷类，哌嗪类，嘌呤类，酰胺类，四环素类，咪唑类等。确证的依据是欧盟2002/657/EC规定，此规定包括了对方法的使用和结果的说明。确证标准采用如下指标，包括特征性、线性曲线、准确度、精确度、重复性、CCα、CCβ，确保了此方法适用于多种药物的筛查，以及较宽的浓度检测范围。最初优化的提取方法和仪器参数是在确定筛查方法之后。我们采取在单个实验室连续4天进行实验，通过分析添加空白样品考察基质效应、回收率、日内重复和日间重复，添加浓度分别为1、2、5、10、50和100ppb，每个浓度重复5次，计算平均回收率，标准偏差，CCα，CCβ，LOD and LOQ。
　　不同兽药不同的物化特性给实验带来了非常大的挑战。饲料样品的提取和净化通过分析样品空白添加而获得，样品提取液为包含0.3％ EDTA-Na2的甲醇/乙腈/柠檬酸缓冲液(37.5/37.5/25，v/v/v)pH4.6的混合溶液，净化采取加入QuEChERS推荐的PSA进行D-SPE。平均回收率为52％-109％，对应的RSD％为2％-20％，超过77％兽药的回收率在65-109％之间，CCα在0.2-1.3μg/kg之间，CCβ在0.3-1.5μg/kg之间。对于尿液基质而言，采用β芳基硫酯酶酶解的方式孵育3小时，然后加入包含0.3％ EDTA-Na2的甲醇/乙腈/琥珀酸缓冲液(37.5/37.5/25，v/v/v)pH4.6的混合溶液，净化同样采取PSA，平均回收率为50-133％，对应的RSD％为2％-23％，LOD在0.02-33.3μg/L间，LOQ在0.07-111μg/L之间。血液基质的前处理方法和饲料一样，平均回收率为48％-122％，LOD在0.02-30μg/L间，LOQ在0.07-100μg/L之间.
　　该实验的目的是为当今市面上广泛使用的饲料产品提供相对简单，重复性高，灵敏度高的检测方法，并兼顾主要的动物源性食品（包括奶牛，家禽，猪和主要的动物物种）。为所有检测的兽药的定性和定量检测提供了可能性，并且说明本方法适合其他复杂的基质。样品采自当地动物饲料安全部门，每一个阳性结果都通过液相色谱质谱进行确证。本方法成功的对一批含有多种兽药残留的实际样品进行检测。检测的57个实际样品中兽药的残留为0.18-111μg/kg，使用最多的是磺胺嘧啶类药物，22个实际血浆样品中兽药的残留为0.2-1.9μg/L。
　　目前已有很多针对动物饲料中药品添加剂检测方法的标准法规。本研究的主要目的是对商业现存的动物饲料残留的多种兽药进行定性定量检测，检测的样品包括直接的饲料以及食用动物的尿液和血浆。为控制食品生产链中最可能对动物和消费者的健康产生影响的污染提供可靠性。

目录

声明

摘要

Abstract

Table of Contents

LIST OF TABLE

LIST OF FIGURES

DEDICATION

Abbreviation

CHAPTER-1 GENERAL INTRODUCTION

1．Introduction

1．1 Veterinary drugs in Animal production

1．2 Effects of antibiotic

1．3 Applications of the veterinary drugs

2 Regulation in C hina

2．1 Banned drugs and substance in feed and animal productions in China

2．2 Food safety standards，rules and regulation in China

2．3 Feed safety supervision and assurance schemes

3．Background of the research

3．1 Simultaneous determination of multi-class veterinary drugs

3．2 Overview the extraction and different matrices for multi-class method

3．3 Validation of the method

4 Objectives of the research

4．1 The specific objectives of the research

4．2 Challenges of the research

4．3 Scope of the study

CHAPTER-2 Development of multi-class veterinary drugs method in feeding stuff

2．Summary

2．1 Introduction

2．MATERIALS AND METHODS

2．2．1 Chemicals and reagents

2．2．2 Standards and stock solutions

2．2．3 Instrumentation and conditions

2．2．4 LC-MS／MS conditions

2．2．5 Feed samples

2．2．6 Protein precipitation

2．2．7 Sample extraction

2．2．8 Matrix match calibration

2．2．9 Method validation

3．RESULTS AND DISCUSSIONS

3．1 Optimization of extraction Procedure

3．2 Sample purification Dispersive-SPE(D-SPE)

3．3 Optimization of the LC-MS／MS conditions

3．4 Method validation

3．5 Recovery

3．6 LOD and LOQ

3．7 Matrix effect evaluation

4．CONCLUSION

CHAPTER-3 Validation of the developed method

3．Summary

3．1 Introduction

3．2 MATERIALS AND METHODS

3．3 RESULTS AND DISCUSSION

3．4．CONCLUSION

CHAPTER-4 Simultaneous determination of the 173 veterinary drug multi-class method in urine

4．Summary

4．1 Introduction

4．2 MATERIALS AND METHODS

4．3 RESULTS AND DISCUSSIONS

4．4 CONCLUSION

CHAPTER-5 Simultaneous determination of the 173 veterinary drugs multi-class method in blood

5．Summary

5．1 Introduction

5．2 MATERIALS AND METHOD

5．3 RESULTSAND DISCUSSION

5．4 CONCLUSION

CHAPTER-6 Method application on survey samples

6．1 Introduction

6．2 MATERIALS AND METHOD

6．2．1 Matrix match calibration

6．2．2 Instrumentation

6．2．3 Feed samples

6．2．4 Urine sample

6．3 RESULTS AND DISCUSSION

6．3．1 Recovery，LOD，and LOQ

6．3．2 Application of the method on real feed samples

6．3．3 Application of the method on real urine samples

6．4 CONCLUSION

REFERENCES

ACKNOWLEDGEMENTS

Author’s Biography