LC-MS/MS联用检测人血浆中帕唑帕尼药物浓度的方法

摘要

本发明公开了一种LC‑MS/MS联用检测人血浆中帕唑帕尼药物浓度的方法，属于药物浓度分析技术领域。它包括取系列帕唑帕尼工作溶液分别与人空白血浆混合、预处理后注入LC‑MS/MS中进行分析，以及向待测人血浆中加入主要由帕唑帕尼‑d6配成的内标工作溶液、预处理后也注入LC‑MS/MS中进行分析，以帕唑帕尼和内标帕唑帕尼‑d6的色谱峰面积比为纵坐标，以人空白血浆中帕唑帕尼的浓度为横坐标制作标准曲线，根据标准曲线计算出待测人血浆样品中的帕唑帕尼浓度；其中，采用蛋白沉淀法对人血浆样品进行预处理，以电喷雾离子源作为电离技术，该检测方法操作简便、灵敏度高、重现性好、选择性高、分析时间短且适合临床样本的大批量检测。

说明书

技术领域

本发明涉及药物浓度的检测方法，属于药物浓度分析技术领域，具体地涉及一种LC-MS/MS联用检测人血浆中帕唑帕尼药物浓度的方法。

背景技术

肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，占肾脏恶性肿瘤的80％以上。RCC发病隐匿，约有30％以上的患者经诊断已发生转移，且RCC对放化疗不够敏感。近10年，随着靶向药物的发展，转移性RCC的治疗进入了靶向治疗时代。

盐酸帕唑帕尼由葛兰素史克公司开发，于2009年10月获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准在美国的上市，商品名为Votrient，用于治疗晚期肾细胞癌、软组织肉瘤、晚期卵巢癌等疾病，属于第二代多靶点酪氨酸激酶抑制剂，对血管内皮生长因子受体、血小板源性生长因子受体等均有明显的抑制作用。其化学结构式如下所示：

分子式：C

盐酸帕唑帕尼是一种多晶型化合物，发明专利WO2011069053A1公开了帕唑帕尼盐酸盐的17种晶型，发明专利CN103232443A保护了一种晶型L及其制备方法、含有它的药物组合物及其在制备抗肿瘤药物方面的用途。发明专利CN107991398A公开了盐酸帕唑帕尼中间体相关杂质的分析测定方法。

帕唑帕尼的检测方法对研究比格犬血浆中帕唑帕尼的药代动力学特征和缩短帕唑帕尼制剂的生物等效性研究周期来说是重要前提。然而，经检索并对相关文献分析对比结果表明：国内公开发表的文献中，已见LC-MS/MS法测定小鼠和大鼠血浆中帕唑帕尼浓度的报道。如文献“LC-MS/MS法测定小鼠血浆中帕唑帕尼的浓度”中，以非索非那定为内标，血浆样品经乙腈沉淀，采用Agilent Zorbax C18色谱柱(2.1mm×100mm，3.5μm)，柱温30℃，流动相为乙腈-水(含0.1％甲酸)(75:25)，流速为0.2mL·min

然而上述检测涉及到小鼠血浆，与人血浆不同，因此，急需开发一种快速、灵敏、准确的人血浆中帕唑帕尼的检测方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明公开了一种LC-MS/MS联用检测人血浆中帕唑帕尼药物浓度的方法，该检测方法通过多反应监测模式进行定性和定量检测，不仅准确度高，而且检测下限低，分析时间短，适宜临床样本的大批量检测。

为实现上述目的，本发明公开了一种LC-MS/MS联用检测人血浆中帕唑帕尼药物浓度的方法，它包括取系列帕唑帕尼工作溶液分别与人空白血浆混合、预处理后注入LC-MS/MS中进行分析，以及向待测人血浆中加入主要由帕唑帕尼-d6配成的内标工作溶液、预处理后也注入LC-MS/MS中进行分析，以帕唑帕尼和内标帕唑帕尼-d6的色谱峰面积比为纵坐标，以人空白血浆中帕唑帕尼的浓度为横坐标制作标准曲线，根据标准曲线计算出待测人血浆样品中的帕唑帕尼浓度；

所述预处理包括加入乙腈沉淀剂→涡旋混合→离心分离→上清液加纯化水→继续涡旋混合。

进一步地，所述乙腈沉淀剂体积为人空白血浆或待测人血浆体积的8～12倍；所述离心分离温度为2～8℃。

进一步地，还包括取系列帕唑帕尼工作溶液分别与人空白血浆混合后配制成6～10个系列校正标样及随行质控样品，所述系列校正标样中帕唑帕尼的浓度为100～30000ng·mL

进一步地，所述随行质控样品包括DQC、HQC、MQC、GMQC、LQC和LLOQ QC；所述DQC中帕唑帕尼的浓度为60000ng·mL

进一步地，所述系列帕唑帕尼工作溶液的配置过程如下：

取帕唑帕尼用二甲基甲酰胺溶解后，继续用甲醇水溶液稀释成帕唑帕尼浓度为100～30000ng·mL

所述内标工作溶液的配置过程如下：

取帕唑帕尼-d6用二甲基甲酰胺溶解后，继续用甲醇水溶液稀释成帕唑帕尼-d6浓度为5000～7000ng·mL

所述甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为1:1。

进一步地，所述LC-MS/MS中的色谱条件包括：

流动相A为100％的水含0.1％甲酸和2mM乙酸铵，流动相B为100％的乙腈，洗脱方式为梯度洗脱，流速为0.2～0.8mL/min。

进一步地，所述色谱条件还包括，色谱柱为ACE Excel 3C18-AR，2.1×50mm；柱温箱温度：30～50℃；

进一步地，自动进样器清洗溶液为甲醇；自动进样器温度为8.0℃；自动进样器清洗模式为进样前清洗和进样后清洗；自动进样器洗针体积为1000μL；自动进样器进样针清洗时浸泡时间为1s；自动进样器进样体积为2.00μL。

进一步地，所述LC-MS/MS中的质谱条件：离子源为ESI源，采用正离子模式、多反应监测模式；电喷雾电压：4000～6000V；涡旋离子喷雾温度：500～600℃；气帘气：40psi；碰撞池气体：中级；离子源气体Gas1：50psi；辅助气Gas2：50psi；数据收集时间：3～5min。

进一步地，所述LC-MS/MS分析过程中，

帕唑帕尼的监测离子对为438.100/357.200，每次扫描一个离子对时所停留的时间150msec，去簇电压85V，碰撞能量40V；

内标帕唑帕尼-d6的监测离子对为444.200/363.400，每次扫描一个离子对时所停留的时间150msec，去簇电压85V，碰撞能量42V。

有益效果：

1、本发明提供的人血浆中帕唑帕尼的定量检测方法，通过采用多反应监测模式进行定性和定量检测，能够有效提高定性准确度和整个检测方法的灵敏度，其中，最低检测限可达到纳克级水平，单个样品的分析时间短至4分钟左右，所需样品量也少，差不多50μL每次即可；

2、本发明提供的人血浆中帕唑帕尼的定量检测方法，在人血浆样品中加入乙腈沉淀剂，较传统固相萃取前处理方法，操作更简单，处理速度快，引进误差小，分离效果好，检测效率高；

3、本发明提供的人血浆中帕唑帕尼的定量检测方法，利用校正标样及随行质控样品确定标准曲线，提高了检测的精密度和准确度，确保定性及定量分析结果的可靠度。

附图说明

图1为本发明设计的待测人血浆中帕唑帕尼浓度测定的代表性标准曲线；

图2为实施例中空白血浆样品中帕唑帕尼和帕唑帕尼-d6的MRM色谱图；

图3为实施例中LLOQ血浆样品中帕唑帕尼和帕唑帕尼-d6的MRM色谱图；

图4为实施例中待测人血浆样品，如1.5h采血点的血浆样本中帕唑帕尼和帕唑帕尼-d6的MRM色谱图；

图5为本发明设计的待测人血浆中帕唑帕尼浓度测定的代表性内标散点图。

具体实施方式

本发明为解决现有技术未涉及检测人血浆中帕唑帕尼的药物浓度报道的技术问题，提供了一种LC-MS/MS联用检测人血浆中帕唑帕尼的药物浓度。该检测方法包括取系列帕唑帕尼工作溶液分别与人空白血浆混合、预处理后注入LC-MS/MS中进行分析，以及向待测人血浆中加入主要由帕唑帕尼-d6配成的内标工作溶液、预处理后也注入LC-MS/MS中进行分析，以帕唑帕尼和内标帕唑帕尼-d6的色谱峰面积比为纵坐标，以人空白血浆中帕唑帕尼的浓度为横坐标制作标准曲线，根据标准曲线计算出待测人血浆样品中的帕唑帕尼浓度；其中，采用蛋白沉淀法对人血浆样品进行预处理，以电喷雾离子源作为电离技术，该检测方法操作简便、灵敏度高、重现性好、选择性高、分析时间短且适合临床样本的大批量检测。

1、本发明检测方法涉及使用的的检测仪器及相关型号如下：

分析天平：XP6百万分之一电子天平，METTLER TOLEDO；

离心机：5810R离心机，Eppendorf；

超声清洗器：KQ-400DE超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；

移液器：0.5～10μL，2～20μL，20～200μL，100～1000μL，Eppendorf；

玻璃样品瓶及螺旋盖：包含1.5mL，4mL，10mL，100mL，500mL，1000mL及2000mL等不同规格，武汉宝因生物科技有限公司；

96孔深孔板：DW-96-22-C，2.2mL，上海百赛生物技术股份有限公司；

聚丙烯离心管：1.5mL，武汉宝因生物科技有限公司；

高效液相色谱泵：LC-20AD，Shimadzu公司；

自动进样器：SIL-20ACMP，Shimadzu公司；

柱温箱：CTO-20AC，Shimadzu公司；

质谱仪：QTRAP5500，ABSciex公司；

2、具体检测过程如下：

(1)储备液和标准工作溶液的配制：

储备液的配制：

精密称取两份一定量的帕唑帕尼对照品至玻璃瓶中，精密加入一定体积的二甲基甲酰胺，配制成浓度为10.0mg·mL

工作溶液的配制：

将配制好的帕唑帕尼储备液用体积比为1:1的甲醇水溶液逐级稀释成浓度为600000ng·mL

同时将平行称量配制的另一份帕唑帕尼储备液也用体积比为1:1的甲醇水溶液逐级稀释成浓度为1200000ng·mL

用体积比为1:1的甲醇水溶液将帕唑帕尼-d6内标储备液稀释成6000ng·mL

(2)血浆样品的预处理：

(2.1)待测人血浆样品的预处理：

取20.0～60.0μL的待测人血浆样品进行预处理，本发明优选取50.0μL待测人血浆样品，加入50.0μL上述步骤(1)配制的内标工作溶液，然后加入500μL乙腈沉淀剂，涡旋混合至少10分钟，继续置于2～8℃的离心机中以4000rpm的离心速度离心处理8～12分钟，之后静置，取部分上部清液至干净的96孔板中，加入纯化水，继续振荡混匀至少3分钟，进行LC-MS/MS分析。其中，本发明优选置于4℃的离心机中以4000rpm的离心速度离心处理10分钟，效果最好。本发明设计采用乙腈作为沉淀剂处理人血浆中蛋白质，处理后的血浆样品的基质干扰效率考察表明基质不干扰检测结果，同时还能够保证提取效率最好，回收率高，杂质干扰少。

其中，上述待测人血浆样品是通过以下临床试验得到：受试者在空腹状态下用240mL温水送服帕唑帕尼片1片/200mg,并且在给药前的60min内，以及给药后0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h、4.5h、5.0h、6.0h、8.0h、10.0h、12.0h、24.0h、48.0h、72.0h、96.0h、120.0h采集静脉血，每次取血约4mL至含EDTA-K2抗凝剂真空采血管中，轻柔颠倒混匀，并立即放置于冰浴中，直立于避光试管盒中直至离心。

(2.2)空白人血浆的预处理：

分别取20μL步骤(1)配制的帕唑帕尼工作溶液，加入到380μL空白人血浆中，经过如步骤(2.1)的预处理过程，得到帕唑帕尼浓度分别为100、200、500、2000、8000、16000、27000和30000ng·mL

将预处理后的所述校正标样、质控样品分别注入LC-MS/MS中进行测定。

(3)LC-MS/MS测定过程工作条件为：

(3.1)色谱条件：

色谱柱：ACE Excel 3C18-AR，2.1×50mm；

流动相A：100％的水含0.1％甲酸和2mM乙酸铵；

流动相B：100％的乙腈；梯度洗脱；

0～1.90分钟：23％→40％B、77％→60％A；

1.90～1.91分钟：40％→95％B、60％→5％A；

1.91～2.60分钟：95％B、5％A；

2.60～2.61分钟：95％→23％B、5％→77％A；

2.61～4.00分钟：23％B、77％A；

其中，以乙腈作为流动相中有机相可使待测物质谱图响应峰值更高，加入0.1％甲酸有利于提高后续质谱分析的离子化效率，而选择加入2mM乙酸铵和0.1％甲酸两种添加剂是为了得到尖锐的峰型和更高的检测灵敏度，保证分析物和内标的保留时间重现性。

自动进样器清洗溶液：甲醇；

柱温箱温度：40℃；

流速：0.45mL/min；

自动进样器温度：8.0℃；

自动进样器清洗模式：进样前清洗和进样后清洗；

自动进样器洗针体积：1000μL；

自动进样器进样针清洗时浸泡时间：1s；

自动进样器进样体积：2.00μL；

其中，具体洗脱梯度如表1所示；

表1本发明设计的洗脱梯度

(3.2)质谱条件：

离子化模式：正离子模式，电喷雾离子源(ESI)；

扫描模式：多反应监测(MRM)；

电喷雾电压：4500V；

涡旋离子喷雾温度：550℃；

气帘气种类：氮气，设置为40psi；

碰撞池气体种类：氮气，设置为8Unit；

雾化气种类：氮气，设置为50psi；

辅助气种类：氮气，设置为50psi；

数据收集时间：约1.9min；

其中，分析物和内标的监测离子对、停留时间、去簇电压和碰撞能量参数见表2。

表2质谱部分条件列表

其中，上述表2中的停留时间指的是在监测离子对时，每次扫描一个离子对时所停留的时间。

(4)分析结果：

进样原始结果见表3，以帕唑帕尼和帕唑帕尼-d6的峰面积比(Analyte Area/ISArea)为纵坐标，人血浆中帕唑帕尼的浓度(ng·mL

表3图1中八个坐标点对应数据

其中，表3中每个标曲样品浓度设置两个2个平行样品；

(5)准确度及精密度评价：

取50.0μL上述由高到低的HQC、MQC、GMQC、LQC、LLOQ QC五个浓度的质控样品各6份，按上述方法操作，连续三天每天处理1个分析批，于处理当天进行LC-MS/MS测定，计算准确度和精密度，结果如下表4所示：

表4准确度及精密度评价表

由上述表4可知，本发明设计的检测方法用来检测日内及日间的多个系列质控样品，表现出准确度高，误差相对较小，且日内日间精密度高的优点。(6)基质效应、高脂效应及溶血效应：

为探讨样品中的内源性物质是否会对待测物帕唑帕尼的离子化效率产生影响，本发明设计考察了高、中、低浓度下血浆样品在空白基质、高脂基质及溶血基质条件下的基质效应，并计算出内标归一化基质效应因子，计算结果如表5所示：

表5基质效应列表

其中，上述表5中，基质效应因子为待测物面积比/内标面积比，由上述表5可知，各随行质控样品的内标归一化基质效应因子介于0.9～1.02之间，精密度小于1.5％，故采用本发明设计的内标物可以最大程度的抵消基质效应带来的影响。

(7)待测物提取回收率：

为考察待测物低中高中低浓度下血浆样品的提取回收率，本发明设计了表6中的血浆样品，并且以常规质控样本为测试样本计算待测物峰面积；以添加待测物和内标的提取后空白基质样本作为参比样本计算待测物峰面积；则二者的比值为待测物提取回收率。

表6提取回收率列表

其中，表6中上标为1的表示常规质控样本的待测物峰面积作为测试样本；上标为2的表示添加待测物和内标的提取后空白基质样本的待测物峰面积作为参比样本。

(8)专属性：

为探讨血浆中内源性物质可能对待测物的定量分析造成影响，本发明设计了表7：

表7专属性列表

由表7可知，血浆中内源性物质不干扰所有待测物的测定，专属性良好，且内标选择亦合适。

(9)血浆样品稳定性：

由于生物样品处理量大，进样时间相对较长，为确保帕唑帕尼生物样品在处理过程中的稳定，不分解，因此需要考察其在经过室温放置、反复冻融以及长期冰冻过程中的稳定性。具体如表8所示；

表8血浆样品稳定性列表

同时，还检测了本发明测量方法的全血稳定性，具体如表9所示；

表9全血稳定性列表

由表8、表9可知，本发明设计的检测方法可以保证不同情况下的生物样品的稳定性。

由上述实施例可知，本发明设计的检测方法，不仅最低检测限可达到纳克级水平，单个样品的分析时间短，而且检测方法稳定性高，基质效应小，检测样品并不因为长时间放置而影响待测物检测的准确性，故本发明设计的检测方法为后续相应的药代动力学参数，缩短帕唑帕尼一致性评价的研究周期，提高帕唑帕尼制剂一致性评价的通过率等奠定了基础。

本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。