猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒感染猪肺泡巨噬细胞差异蛋白的筛选及验证

摘要

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）是猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS virus, PRRSV）引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸障碍为特征的急性传染病。1987年，该病在美国首次报道。2006年，中国爆发高致病性PRRS，除了经典症状以外，以高致病率与高死亡率为主要特点。PRRSV为单股正链RNA病毒，属于套式病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属；基因组在核糖体移码框的作用下转录并翻译为pp1a与pp1ab两段多肽，并在其自身产生的水解酶的作用下，将这两条多肽链消化产生多于12种非结构蛋白，这些非结构蛋白会参与结构蛋白的合成，与此同时，产生的结构蛋白与非结构蛋白会一同协作，参与病毒感染宿主细胞的过程。PRRSV具有严格的细胞嗜性，在患猪体内病毒主要靶细胞是肺泡巨噬细胞（PAM）以及不同组织的单核巨噬细胞，不同毒力的毒株感染 PAM效率有显著差异，导致这种差异的机制尚不清楚。
　　本研究以高致病性PRRSV HuN4强毒株与其传代致弱的HuN4-F112弱毒株为参考毒株，构建重组EGFP-PRRSV强弱毒感染性克隆，感染和纯化PAM，进行定性蛋白质谱分析；同时以其亲本强弱毒感染宿主PAM细胞膜蛋白进行定量蛋白质谱分析，筛选及验证与病毒相互作用PAM细胞膜差异蛋白，可揭示PRRSV不同毒力毒株感染细胞效率差异的分子基础，为PRRSV致病机制的研究提供理论依据。
　　为了纯化和筛选与PRRSV相互作用的宿主细胞膜蛋白，本研究首先分别构建了含增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的重组PRRSV强弱毒感染性克隆，作为指示病毒，为筛选及验证与PRRSV相互作用的 PAM细胞膜蛋白提供技术支撑。以 PRRSV HuN4感染性克隆以及其传代致弱毒株HuN4-F112感染性克隆为骨架，利用反向遗传操作技术，在其病毒基因组ORF1b和ORF2a之间插入egfp基因，并在外源基因3?端下游插入该病毒的转录调控序列6（TRS6），构建重组病毒感染性分子克隆pHuN4-EGFP和pHuN4-F112-EGFP，并通过转染拯救出重组病毒。在MARC-145细胞中，将重组病毒连续传代，其外源egfp基因仍能够持续表达，表明该重组病毒具有良好的遗传稳定性。重组病毒在病毒滴度、噬斑形态、生长能力等方面与亲本毒无明显差异。
　　在获得具有能够持续表达绿色荧光蛋白的重组PRRSV强弱毒之后，将强弱毒重组病毒分别感染PAM，纯化PAM，提取细胞膜蛋白进行定性蛋白质谱分析，筛选及验证与病毒相互作用PAM细胞膜差异蛋白。结果表明，在分选流式仪的FITC通道中，可获得强弱重组病毒感染PAM而产生的绿色荧光信号，分选出重组病毒感染的PAM，获得了纯化的细胞膜蛋白，利用Shotgun方法进行了膜蛋白定性蛋白质谱分析，获得的蛋白信息进行GO注释，并按蛋白分类分析，筛选出强弱毒差异蛋白93个。对选择的5个相关蛋白进行标签融合和真核上调表达试验，发现Apolipoprotein M、JUP、Apolipoprotein A-IV和 Kexin type9对强毒存在抑制作用，推测为抵御PRRSV感染的宿主蛋白；Clusterin isoform x1对强毒的感染存在上调作用，推测可能是PRRSV感染的宿主受体蛋白。
　　以其亲本强弱毒感染宿主 PAM细胞膜蛋白进行了定量蛋白质谱分析，筛选及验证了与病毒相互作用PAM细胞膜差异蛋白。结果表明，通过Label-free定量蛋白质组分析，获得差异蛋白95个，其中确定定位在膜上26个；通过Western Blot验证了KDEL受体以及Histone H3蛋白，发现与质谱结果中强弱毒组检测结果一致，证明了质谱的可靠性；通过 String analysis方法寻找强弱毒之间的差异感染机制，揭示了不同毒力PRRSV感染PAM的差异潜在信号通路。

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第一章 引 言

1.1PRRSV病原学概述

1.1.1 病毒的基因组结构特征

1.1.2 病毒的编码的蛋白

1.1.3 病毒感染细胞机制

1.1.4 PRRSV进入宿主细胞RIG-I信号通路

1.1.5 PRRSV进入宿主细胞TLR3信号通路

1.1.6 PRRSV进入宿主细胞NF-κB信号通路

1.2反向遗传操作技术

1.2.1 RNA病毒反向遗传学技术

1.2.2 RNA病毒反向遗传学的研究进展

1.2.3 PRRSV反向遗传学的研究进展

1.3分选流式细胞术

1.3.1流式细胞术的原理

1.3.2流式细胞术的研究进展

1.4蛋白质组学概述

1.4.1常用的蛋白质组学研究技术

1.4.2 Shotgun定性质谱的研究进展

1.4.3 Label-free定量质谱的研究进展

1.5 研究目的和意义

第二章 重组EGFP猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆构建

2.1 实验材料

2.1.1 病毒株

2.1.2 细胞

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要仪器设备

2.1.5 引物及设计

2.2 实验方法

2.2.1 重组病毒感染性克隆的构建

2.2.2 病毒拯救及纯化传代

2.2.3 重组病毒的PCR 鉴定

2.2.4 重组病毒报告基因表达的鉴定

2.2.5 重组病毒的间接免疫荧光的鉴定

2.2.6 重组病毒的生物学特性鉴定

2.3 结果

2.3.1 EGFP重组PRRSV的全长克隆的构建与感染性检测

2.3.2 重组病毒与亲本病毒结构蛋白表达分析结果

2.3.3重组病毒与亲本病毒生物学特征分析结果

2.4 讨论

第三章与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白的筛选及验证

3.1 材料

3.1.1 病毒株

3.1.2细胞

3.1.3主要试剂

3.1.4 主要仪器设备

3.2 方法

3.2.1 PAM细胞分离培养

3.2.2 Shotgun质谱分析重组病毒感染PAM细胞的制备

3.2.3 Label-free质谱分析亲本病毒感染PAM细胞的制备

3.2.4 Shotgun定性质谱分析

3.2.5 Label-free定量质谱分析

3.2.6 Shotgun质谱目的蛋白过表达验证

3.2.7 Label-free质谱分析目的蛋白WB验证

3.3结果

3.3.1 PAM细胞的分离培养

3.3.2 重组病毒感染PAM细胞

3.3.3 绿色荧光信号检测

3.3.4 Shotgun定性质谱分析结果

3.3.5 Label-free定量质谱分析结果

3.3.6 Shotgun质谱分析目的蛋白的过表达验证结果

3.3.7 Label-free质谱分析目的蛋白WB验证结果

3.4讨论

第四章 全文总结

参考文献

致谢

作者简介