白菜eIF(iso)4E基因对TuMV的抗性机制研究

摘要

大白菜（B.rapa L. ssp. pekiensis）起源于中国，是我国重要的蔬菜作物之一。病毒病是大白菜生产中的三大病害之一，严重影响了大白菜的生产。经鉴定，芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus， TuMV)是侵染大白菜的主要病原。
　　本研究基于大白菜抗TuMV的隐性基因retr02（编码eIF(iso)4E蛋白），开发功能标记，用于分子标记辅助选择育种，并通过酵母双杂交试验对TuMV株系与大白菜eIF(iso)4E基因间互作关系及互作关键位点进行分析研究，获得以下研究结果：
　　1、经过retr02和Retr02序列比对发现，retr02由于exon1/intron1连接处的Insert G造成错误剪切，以致翻译时提前终止，致使功能丧失。在该位点处开发KASP_retr02和dCAPS-BslI标记，对142株F2单株进行筛选鉴定，鉴定结果与接种病毒后ELISA检测结果一致。将KASP_retr02和dCAPS-BslI标记用于分子标记辅助育种，对118份自交系材料进行筛选，选出抗病材料2份，感病材料116份。‘80186’为国家级抗病亲本材料，但KASP_retr02和dCAPS-BslI标记的检测结果却为感病。推测‘80186’材料不含有retr02抗病位点，应该含有其他抗病基因或抗病机制。dCAPS-BslI标记和KASP_retr02标记的检测结果一致，但dCAPS-BslI标记操作复杂，而KASP_retr02便于生产上使用。
　　2、白菜作物中eIF(iso)4E基因含有三个拷贝，分别为eIF(iso)4E.a、eIF(iso)4E.b和eIF(iso)4E.c，经鉴定， eIF(iso)4E.b为假基因。通过酵母双杂交试验表明：pGBKT7:C4 VPg与pGADT7:eIF(iso)4E.a可以相互作用，而与pGADT7:eIF(iso)4E.c不能相互作用；pGBKT7:CDN1 VPg与eIF(iso)4E.c相互作用，而与pGADT7:eIF(iso)4E.a不能相互作用。不同的TuMV株系与不同的eIF(iso)4E拷贝进行互作。
　　3、通过对eIF(iso)4E蛋白三级结构分析，该蛋白包含有帽结合蛋白结构，其中eIF(iso)4E.a与eIF(iso)4E.c之间存在20个差异氨基酸，其中17个差异氨基酸位于帽结合蛋白结构上（占85％）。病毒侵染植株，在翻译起始因子异构体eIF(iso)4E与TuMV-VPg相互作用的过程中，eIF(iso)4E蛋白的帽结合结构对于不同TuMV株系的侵染起了关键作用。
　　4、TuMV-C4和TuMV-CDN1的VPg氨基酸序列进行比对，发现内部有5个差异氨基酸位点，即第52位I/L,第97位E/K,第101位N/D,第105位N/D和第117位I/V。利用重叠延伸PCR技术，以TuMV-C4 VPg质粒为模板，定点突变获得5个单突变体基因。并将这5个单突变体基因构建酵母 pGBKT7载体。通过酵母双杂交试验结果表明：pGBKT7:C4 VPg与pGADT7:eIF(iso)4E.a互作过程中，TuMV-C4 VPg的 I、II、IV和 V差异位点起关键作用；pGBKT7:C4 VPg与pGADT7:eIF(iso)4E.c互作过程中，TuMV-C4 VPg的I差异位点起关键作用。在TuMV和白菜长期的进化中，对于不同的TuMV株系，eIF(iso)4E基因中决定与其相互作用的关键氨基酸也不同，该研究为进一步分析二者的协同进化机制奠定基础。

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第一章 绪 论

1.1 TuMV研究进展

1.2 芸薹属对TuMV抗性研究进展

1.3 植物对病毒的抗性机制研究

1.4 本研究的目的和意义

第二章 基于白菜抗TuMV的retr02基因功能标记开发

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

第三章 TuMV株系与eIF(iso)4E互作关系研究

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

第四章 白菜eIF(iso)4E基因互作关键位点研究

4.1 材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

第五章 TuMV VPg基因互作关键位点研究

5.1 材料和方法

5.2 结果

5.3 讨论

第六章 文总结

6.1 于白菜抗TuMV的retr02基因功能标记开发

6.2 TuMV株系与eIF(iso)4E互作关系研究

6.3 白菜eIF(iso)4E基因互作关键位点分析

6.4 TuMV VPg基因互作关键位点分析

参考文献

附录

致谢

作者简历

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