白菜eIF(iso)4E基因与TuMV VPg互作机理解析

摘要

病毒病是影响大白菜生产的三大病害之一。芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus，TuMV)属于马铃薯Y病毒科Y病毒属，是唯一侵染芸薹属作物的马铃薯Y病毒属病毒。目前芸薹属作物中已定位、克隆约20个抗TuMV基因，进一步揭示白菜抗TuMV的分子机制，有助于对白菜抗TuMV分子改良，同时对芸薹属蔬菜抗TuMV性状的遗传改良具有重要的指导意义和应用价值。 白菜翻译起始因子是一类重要的隐性抗TuMV基因。本研究从8份白菜材料中克隆eIF4E/eIF(iso)4E基因拷贝，确定其与TuMV不同株系的互作关系，探究eIF(iso)4E与TuMV互作的关键氨基酸位点，并分析关键位点对蛋白空间结构的影响，构建互作模型，获得以下结果: 1、在8份抗/感TuMV的白菜高代自交系材料中克隆eIF4E和eIF(iso)4E基因，获得eIF4E.a、eIF4E.c、eIF(iso)4E.a和eIF(iso)4E.c拷贝。对不同材料间eIF4E和eIF(iso)4E蛋白氨基酸序列进行比对，发现eIF4E蛋白氨基酸序列变异较大，而eIF(iso)4E蛋白氨基酸序列变异较小。 2、通过酵母双杂交试验(Y2H)和双分子荧光互补试验(BiFC)分析，TuMV C4/CDN1/UK1/CHN2/CHN3株系与白菜eIF4E不互作，与eIF(iso)4E互作。TuMV C4/CHN2/CHN3株系与白菜eIF(iso)4E.a互作，与eIF(iso)4E.c不互作，而TuMV CDN1/UK1株系与白菜eIF(iso)4E.c互作，与eIF(iso)4E.a不互作。TuMV UK1株系属于第1致病型，TuMV C4/CHN2/CHN3株系属于第3致病型，TuMV CDN1株系属于第4致病型。TuMV C4/CHN2/CHN3株系与白菜eIF(iso)4E互作关系一致，推测同一致病型TuMV株系与白菜eIF(iso)4E的互作关系一致。 3、通过SOE-PCR技术，定点突变TuMV C4/CDN1VPg间5个差异氨基酸位点，TuMVUK1/CHN2VPg间5个差异氨基酸位点，白菜BraA.eIF(iso)4E.c-1/2间4个差异氨基酸位点。通过酵母双杂交试验(Y2H)和双分子荧光互补试验(BiFC)分析，TuMV VPg蛋白的第I52L和L186F位氨基酸变异、白菜BraA.eIF(iso)4E.c蛋白的第L36F位氨基酸变异，在TuMV与白菜eIF(iso)4E互作中起关键作用。 4、利用Phyre2软件对白菜BraA.eIF(iso)4E.c-1蛋白空间结构进行同源模建，该蛋白包含8个β折叠，3个α螺旋和3个延伸环状结构。蛋白整体结构向内凹陷，形成一个“口袋”结构，“口袋”的核心区域是疏水中心。白菜BraA.eIF(iso)4E.c-1蛋白和BraA.eIF(iso)4E.c-2蛋白间差异四个氨基酸位点，分别为F36L，A52V，I80T和P150Q，第36位氨基酸正位于“口袋”疏水核心，且苯丙氨酸(F)和亮氨酸(L)的氨基酸性质差异较大，前者为芳香族氨基酸（包含苯环结构），后者为脂肪族氨基酸。而第52、80和150位氨基酸变异对白菜eIF(iso)4E蛋白空间结构影响较小。 5、根据TuMV与白菜eIF(iso)4E的互作关系，以及互作中关键氨基酸位点分析结果，构建二者的互作模型。白菜eIF(iso)4E与TuMV VPg互作，促进病毒在植株内繁殖、传播。当TuMVVPg蛋白氨基酸发生变异(例如I52L)，TuMV VPg蛋白空间结构发生变化，不能和白菜eIF(iso)4E蛋白相互作用;当白菜eIF(iso)4E蛋白氨基酸发生变异(L36F)，白菜eIF(iso)4E蛋白空间结构发生变化，不能和TuMV VPg蛋白相互作用，此时，TuMV遗传物质RNA不能在植物体内进行自身复制和传播，此时植株对TuMV产生抗性。