大、小鼠来源日本血吸虫凋亡相关基因的差异表达分析及Sjcaspase3/7的克隆、真核表达和生物学功能分析

摘要

日本血吸虫病是一种危害严重的人畜共患寄生虫病，仍是我国重要的公共卫生问题之一。截止到2013年底，我国仍推算有血吸虫病人18多万例。至今，仍没有理想的血吸虫病疫苗可在现场应用，血吸虫病防治仍主要依靠大规模的吡喹酮化疗，且已有血吸虫对吡喹酮产生抗药性的报道。因此，迫切需要筛选治疗血吸虫病新药物。细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种主要方式，日本血吸虫细胞凋亡的研究可为日本血吸虫新药靶的筛选提供新思路。
　　本研究通过对日本血吸虫全基因组信息挖掘，鉴定了15个日本血吸虫凋亡相关基因。通过RT-PCR技术分析了这些凋亡相关基因在适宜性宿主BALB/c小鼠和非适宜性宿主Wistar大鼠来源的不同时期的日本血吸虫中的转录水平和表达差异，对其中重要的差异表达基因 Sjcaspase3/7进行了克隆、真核表达及生物学功能分析，为深入研究日本血吸虫凋亡机制和新药靶的鉴定奠定了基础。
　　1.大、小鼠来源日本血吸虫凋亡相关基因的表达分析
　　分别收集了BALB/c小鼠和Wistar大鼠来源14d,23d,32d,42d四个时期共八组日本血吸虫虫体，利用Trizol提取虫体的总RNA并反转录成cDNA。利用日本血吸虫全基因组本地BLAST数据库搜索，共获得了15个与日本血吸虫细胞凋亡相关的基因。通过RT-PCR分析了这15个凋亡相关基因在不同宿主和不同期别的表达情况。初步分析结果表明两种宿主来源的日本血吸虫凋亡相关基因的表达情况存在差别，其中早期（14d）虫体中凋亡基因表达差异较小，但自23d起，大鼠来源虫体中凋亡相关基因高表达数量明显高于小鼠来源虫体，这可能是影响日本血吸虫在非适宜性宿主大鼠体内生长发育的重要因素之一。进一步分析表明日本血吸虫至少存在一条完整但相对简单的内源性凋亡通路（线粒体通路）。本研究为深入研究日本血吸虫与宿主的相互作用机制和日本血吸虫的凋亡机制奠定了基础。
　　2.日本血吸虫Sjcaspase7的克隆、真核表达及生物学功能分析
　　本研究对日本血吸虫凋亡基因 Sjcaspase7进行了克隆并成功构建了真核表达质粒 pXJ40-FLAG-Sjcaspase7。IFA结果显示Sjcaspase7成功在Hela细胞中表达。Western Blotting结果分析表明重组蛋白Sjcaspase7分子量约为36KDa。Caspase酶活检测实验结果表明rSjcaspase7重组蛋白具有切割底物DEVD的活性，同时该活性可以被抑制剂Z-DEVD-FMK所抑制。流式细胞术分析结果表明Sjcaspase7可诱导Hela发生早期细胞凋亡。通过体外RNA干扰筛选首先得到一组对Sjcaspase7干扰效果明显的小干扰 RNA(SiRNA-883)。体内干扰实验也证明了 SiRNA-883对日本血吸虫Sjcaspase7的表达具有一定的干扰效果。动物实验结果表明：与对照组相比，虫体Sjcaspase7基因下调表达了32.59％；干扰组虫荷数和肝脏虫卵数分别下降了30.77%和28.85%。同时，对各组虫体Caspase酶活检测发现干扰组酶活比对照组下降了89.73%，结果表明Sjcaspase7对日本血吸虫的生长和发育产卵可能具有重要作用。本研究为深入研究日本血吸虫凋亡基因Sjcaspase7的生物学功能及日本血吸虫的凋亡机制奠定了理论基础。
　　3.日本血吸虫Sjcaspase3的克隆、真核表达及生物学功能分析
　　利用PCR技术扩增获得Sjcaspase3基因的编码序列，其ORF含900bp，编码299个氨基酸，理论分子量为33509.7Da，理论等电点为6.39。Real-time PCR分析表明该基因在检测的各阶段日本血吸虫中普遍表达，其中21d表达量最高，42d雌虫表达量高于42d雄虫。成功构建了pXJ40-FLAG-Sjcaspase3重组质粒并转染到 Hela细胞内，荧光定量 PCR和 Western Blotting分析表明Sjcaspase3成功在Hela细胞中表达。酶活实验提示重组rSjcaspase3蛋白具有切割特异性底物天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸（DEVD）的活性。流式细胞术分析表明Sjcaspase3可诱导Hela细胞发生早期细胞凋亡。本研究为深入探讨Sjcaspase3的生物学功能及日本血吸虫细胞凋亡机制奠定了基础。
　　综上，本研究对不同适宜性宿主大鼠和小鼠不同期别的日本血吸虫凋亡相关基因的表达情况进行了比较分析，对大、小鼠来源虫体差异表达的凋亡基因Sjcaspase7和Sjcaspase3进行了克隆、表达和生物学功能初步分析。本文为深入研究日本血吸虫的凋亡机制及抗血吸虫新药靶的筛选提供了重要基础。

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英文缩略表

第一章 引 言

1.1血吸虫与血吸虫病

1.2血吸虫病需要新的治疗方法

1.3细胞凋亡

1.4细胞凋亡通路

1.5日本血吸虫细胞凋亡观察

1.6日本血吸虫重要凋亡基因的研究

1.7日本血吸虫半胱天冬酶（Caspase）家族相关研究

1.8日本血吸虫凋亡与药物靶点的研究

1.9本文总体研究思路

第二章 大、小鼠来源日本血吸虫凋亡相关基因的表达分析

2.1. 引言

2.2. 实验材料

2.3. 实验方法

2.4. 实验结果

2.5. 讨论

第三章 日本血吸虫凋亡基因Sjcaspase7的克隆、真核表达及生物学功能分析

3.1引言

3.2实验材料

3.3实验方法

3.4实验结果

3.5讨论

第四章 日本血吸虫凋亡基因Sjcaspase3的克隆、真核表达及生物学功能分析

4.1. 引言

4.2. 实验材料

4.3. 实验方法

4.4. 实验结果

4.5. 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历