小鼠可溶性PD1的克隆、真核表达及生物学活性检测

摘要

旨在克隆小鼠PD1胞外区(简称mPD-1)基因,利用真核表达系统表达有活性的分泌型mPD-1蛋白,初步研究其生物学活性.克隆mPD-1基因,将其连入pcDNA3.1(+)/Fc中获得pcDNA3.1(+).Fc/mPD-1重组表达质粒,转化至大肠杆菌DH5α,进行PCR和双酶切鉴定,并送测序.将阳性质粒转染L929细胞,利用RT-PCR和western blotting 方法鉴定mPD-1/L929稳定表达株.利用Alamar Blue法检测分泌的mPD-1蛋白对淋巴细胞增殖的影响,评价其生物学活性.结果显示,成功构建重组质粒pcDNA3.1(+)-Fc/mPD-1,转染了pcDNA3.1(+)-Fc/mPD-1的L929细胞可将mPD-1蛋白分泌至胞外.Alamar Blue检测结果显示,真核细胞分泌的mPD-1蛋白作用于混合淋巴细胞,与阴性对照相比,可明显促进淋巴细胞的增殖.本试验成功地克隆mPD-1胞外区蛋白,并在L929细胞中得到了分泌型表达.分泌的重组蛋白可有效促进淋巴细胞增殖,为进一步研究其功能和临床应用提供了条件.