软籽石榴种子硬度的影响因素及转录组分析

摘要

石榴（Punica granatum L.）是石榴科（Punicaceae）石榴属（Punica L.）果树，集社会效益、生态效益、经济效益、观赏价值与保健功能于一身。‘突尼斯软籽’石榴仁软籽多，食用时不吐子，使石榴种仁中富含的多种脂肪酸和蛋白等营养物质得到利用；其市场售价是普通品种的2-4倍，能极大的增加农民收入。试验从影响‘突尼斯软籽’种子硬度的几种因素及其转录组测序两个方面对石榴的种子硬度进行了相关分析，为提高软籽石榴果实品质及其分子辅助育种提供理论依据。主要结果如下：
　　1、对花后20、40和60 d的种子结构进行观察及花后120 d‘突尼斯软籽’和‘豫大籽’两个品种的种子大小、种子硬度及木质素含量进行测量。结果发现：花后20 d，两个品种的种皮和胚均未发育；花后40 d，种皮开始形成，而胚未形成；花后60 d，种皮与胚均已形成；花后120 d种子的大小、硬度及木质素含量均为‘豫大籽’＞‘突尼斯软籽’，且木质素含量与种皮硬度呈正相关。石榴种子的发育过程：先形成种皮、后形成胚。在一定树龄范围内，‘突尼斯软籽’石榴的种子硬度及木质素含量随树龄的增大而减小。而同一树龄不同坐果位置其果实的种子硬度及木质素含量也不同，分别是南＜东＜北＜西，中层＜上层＜下层。
　　以‘突尼斯软籽’石榴为母本，‘豫大籽’等7个品种的花粉做父本进行人工授粉试验。结果发现，‘突尼斯软籽’的果实均为软籽，其中‘突尼斯软籽’自花授粉获得的果实种子硬度最小。在花后40 d对‘突尼斯软籽’果实套袋，分别于套袋后20 d、40 d、60 d及80 d去袋，设置未套袋果实为对照。结果发现：套袋时间对种子的硬度无显著影响。在‘突尼斯软籽’石榴施肥试验中，设置施用复合肥、钾肥、磷肥、尿素及未施肥共五个试验组，测量其对种子硬度的影响。结果发现，磷肥的施用可以明显降低石榴的种子硬度。
　　2、通过对花后30 d、60 d和120 d的‘三白’石榴（硬籽，种子硬度﹥4.2 kg/cm2）与‘突尼斯软籽’石榴（软籽，种子硬度﹤3.67 kg/cm2）种子为材料进行转录组测序，测序共获得35.1 G的数据量，利用从头组装共得到了132287条组装的转录本序列和105743条有代表性的Unigenes序列，共注释得到76806条完整的蛋白编码序列，并挖掘众多SSR。两个石榴品种的种子硬度与木质素合成代谢相关，包括等CCR、CCoA-OMT、PAL等关键酶基因及WRKY、MYB、NAC等转录因子。在硬籽石榴中，木质素相关基因、纤维素合成相关基因、MYB转录因子表达水平较高；在软籽石榴中，类黄酮类相关基因、细胞程序性死亡相关基因表达水平较高。转录组测序结果初步揭示了两个品种花后30 d、60 d和120 d的基因表达情况等转录信息，丰富了石榴的分子数据库。

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第一章 引 言

1.1 软籽石榴的研究进展

1.1.1 软籽石榴品种选育

1.1.2 软籽石榴的试验研究

1.1.3 软籽石榴研究的前景

1.2 木质素的研究进展

1.2.1 木质素的组成结构

1.2.2 木质素合成途径

1.2.3 木质素合成途径的基因调控

1.2.4 存在问题

1.3果树上转录组技术的应用

1.3.1 转录组测序的方法与流程

1.3.2 转录组测序在果树上的研究进展

1.3.3 转录组测序在果树上的应用前景

1.4 本研究的目的与意义

1.5技术路线

第二章 影响软籽石榴种子硬度的几个因素

2.1 各影响因素试验的材料与方法

2.1.1‘突尼斯软籽’与‘豫大籽’种子硬度大小比较

2.1.2 不同授粉品种对种子硬度的影响

2.1.3 不同树龄对种子硬度的影响

2.1.4套袋对种子硬度的影响

2.1.5 肥料对种子硬度的影响

2.1.6 坐果位置对种子硬度的影响

2.2结果与分析

2.2.1‘突尼斯软籽’与‘豫大籽’种子硬度大小比较

2.2.2不同授粉品种对种子硬度的影响

2.2.3不同树龄对种子硬度的影响

2.2.4套袋对种子硬度的影响

2.2.5 肥料对种子硬度的影响

2.2.6 坐果位置对种子硬度的影响

2.3讨论

第三章 软籽石榴种子硬度的转录组分析

3.1 材料与方法

3.1.1材料

3.1.2 方法

3.2结果与分析

3.2.1两个品种四个时期的果实及种子外观

3.2.2两个石榴品种的种子硬度及木质素测量

3.2.3 测序数据的初步分析

3.2.4 基因的功能注释

3.2.5 差异基因表达分析

3.2.6候选基因筛选

3.2.7 实时荧光定量PCR验证

3.3讨论

第四章 结论

参考文献

致谢

作者简历