蜂胶中酚酸和酚酸酯对脂代谢紊乱的调控作用

摘要

蜂胶是蜜蜂从自然界的植物组织上采集的天然产物，其含有丰富的多酚类化合物，这些物质构成其生物活性和药理功能的多样性。近年发现蜂胶具有显著的抗氧化、抗炎症、抗微生物、抗肿瘤、抗糖尿病、调控脂代谢和免疫调节等生物活性。目前由于脂代谢紊乱引起的肥胖、糖尿病、心脑血管疾病等引起了人们高调重视，大量的研究发现天然产物是控制和预防疾病的有效药物来源。以往的实验表明，蜂胶的提取物和其中一些成分如高良姜素、槲皮素、p-香豆酸和咖啡酸苯乙酯等具有调控脂肪代谢的生物活性，但鲜有研究进一步报道蜂胶中其他化合物，特别是酚酸和酚酸酯能够参与调控，以及化合物的作用机制。因此本文旨在研究中国蜂胶中的主要酚酸和酚酸酯成分对脂代谢紊乱的调控，明确有效成分和探究相关作用机制。
　　本文对中国蜂胶中主要的八种酚酸（咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、异阿魏酸、3，4-二甲氧基肉桂酸、肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸和亚桂皮乙酸），八种酚酸酯（咖啡酸苯乙酯、咖啡酸肉桂酯、咖啡酸苄酯、p-香豆酸肉桂酯、p-香豆酸苄酯、阿魏酸苄酯、肉桂酸肉桂酯和4-甲氧基肉桂酸肉桂酯）和3，4-二羟基苯甲醛进行研究。用MTT法检测了这些成分对人肝细胞L02和小鼠前脂肪细胞3T3-L1的细胞活力影响，确定了药物治疗的作用浓度。先建立L02肝细胞脂质累积模型，用油红O染色法筛选出蜂胶的酚酸和酚酸酯中降脂效果最佳的成分，然后研究最佳成分对细胞内内质网应激和氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）蛋白表达的影响;最后建立3T3-L1脂肪细胞脂肪因子分泌紊乱模型，检测这17种成分作用后脂肪因子和炎性因子的胞外分泌。
　　本研究发现蜂胶酚酸中的p-香豆酸和异阿魏酸，芳香醛3，4-二羟基苯甲醛，还有酚酸酯中的p-香豆酸苄酯、p-香豆酸肉桂酯、咖啡酸苯乙酯、咖啡酸苄酯和咖啡酸肉桂酯能够有效降低游离脂肪酸诱导的L02细胞的脂质累积。其中咖啡酸肉桂酯是唯一一个在四个给药浓度(5、10、50、100μmol/L)下都具有明显降脂作用的化合物，且是蜂胶中含量较多，以往的研究也很少关注的成分。通过蛋白质免疫印迹技术检测L02细胞内质网应激蛋白和调控过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)蛋白的表达水平，咖啡酸肉桂酯能够有效降低内质网应激中标志蛋白CHOP和ATF-6的水平，上调PPAR-α和下调PPAR-γ的表达，改善细胞内脂质代谢紊乱。
　　多因子检测试剂盒检测了蜂胶中17个酚酸类成分对与脂肪细胞炎症相关的七个细胞因子的表达，即三个脂肪因子脂联素(Adiponectin)、瘦素(Leptin)和抵抗素（Resistin），两种炎症因子白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子(TNF-α)，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和纤维蛋白溶酶原激活物抑制蛋白(PAI)。蜂胶中17个酚酸类成分都能不同程度调控脂肪因子的分泌异常，同一种化合物能够作用的细胞因子范围不一样。
　　从蜂胶中17种酚酸和酚酸酯筛选出的成分能够调控两种类型脂代谢紊乱，明确了作用靶点，也为进一步研究蜂胶在治疗相关疾病的应用提供了先期实验依据。

目录

声明

摘要

英文缩略表

1．1．1 蜂胶的基本介绍

1．1．2 蜂胶的来源

1．1．3 蜂胶的化学组成

1．2 蜂胶的生物活性和药用功能

1．3 蜂胶和脂代谢紊乱

1．3．1 脂代谢紊乱的基本概念

1．3．2 蜂胶对脂质代谢紊乱作用的研究进展

1．4 本论文立题依据

1．5 主要研究内容

第二章 蜂胶中酚酸和酚酸酯及其对细胞活性影响

2．1 实验材料和仪器

2．1．1 材料与试剂

2．1．2 耗材与仪器

2．2 实验方法

2．2．1 基本试剂的配制

2．2．2 蜂胶原料的处理

2．2．3 HPLC色谱条件

2．2．4 蜂胶中酚酸和酚酸酯成分的鉴定和定量分析

2．2．5 细胞的培养

2．2．6 MTT试验法检测酚酸和酚酸酯的对细胞活力影响

2．2．7 统计学分析

2．3 结果和分析

2．3．1 蜂胶中主要酚酸和酚酸酯成分

2．3．2 酚酸和芳香醛对L02细胞活力的影响

2．3．3 酚酸酯对L02细胞活力的影响

2．3．4 酚酸和芳香醛对3T3-L1细胞活力的影响

2．3．5 酚酸酯对3T3-L1细胞活力的影响

2．3．6 小结

第三章 蜂胶中酚酸和酚酸酯对L02细胞脂质累积的影响

3．1 实验材料和仪器

3．1．1 材料与试剂

3．1．2 耗材与仪器

3．2 实验方法

3．2．1 基本试剂的配制

3．2．2 细胞脂质累积模型的建立

3．2．3 酚酸和酚酸酯对L02细胞脂质累积的作用

3．3 结果与分析

3．3．1 PA诱导L02细胞产生胞内脂质累积

3．3．2 蜂胶中酚酸和芳香醛对L02细胞脂质累积的影响

3．3．3 蜂胶中酚酸酯对L02细胞脂质累积的影响

3．3．4 小结

第四章 咖啡酸肉桂酯对L02细胞内质网应激和PPARs蛋白的影响

4．1 实验材料和仪器

4．1．1 材料与试剂

4．1．2 耗材与仪器

4．2 实验方法

4．2．1 基本试剂的配制

4．2．2 PA和咖啡酸肉桂酯刺激L02细胞后的样品收集

4．2．3 样品的蛋白浓度测定

4．2．4 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)及考马斯亮蓝染色

4．2．5 蛋白免疫印迹实验(Western Blot)方法

4．3 结果与分析

4．3．1 咖啡酸肉桂酯对L02细胞内质网应激的影响

4．3．2 咖啡酸肉桂酯对L02细胞PPARs蛋白的影响

4．3．3 小结

第五章 蜂胶中酚酸和酚酸酯对3T3-L1细胞因子分泌的影响

5．1 实验材料和仪器

5．1．1 材料与试剂

5．1．2 耗材与仪器

5．2 实验方法

5．2．1 基本溶液的配制

5．2．2 3T3-L1细胞诱导成熟分化的方法

5．3．2 白细胞介素-6(IL-6)

5．3．3 瘦素(Leptin)

5．3．5 抵抗素(Resistin)

5．3．6 纤维蛋白溶酶原激活物抑制蛋白(PAI)

5．3．7 肿瘤坏死因子(TNF-α)

5．3．8 小结

第六章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历