FMDV非结构蛋白抗体化学发光快速检测试剂盒的研发

摘要

口蹄疫(foot-and-mouth diseases，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth diseases virus，FMDV)引起的危害猪、牛、羊等偶蹄动物的重大动物传染病。在临床诊断中，早期、快速、准确地检测FMDV感染对于防控FMD的大流行来说是至关重要的。化学发光免疫分析(chemiluminiscence immunoassay, CLIA)作为最新的标记检测技术，由于其具有极高的敏感性、信噪比以及宽的线性范围而在诊断艾滋病、肝炎、肿瘤等领域广泛应用。目前关于诊断FMD的CLIA方法还未见报道。
　　本研究利用原核表达系统成功表达了FMDV的非结构全长蛋白3ABC、2C和五株位于3A、3B上的单表位蛋白分别命名为3Aepi1、3Aepi2、3Bepi1、3Bepi2、3Bepi3。其中，3ABC和2C蛋白以包涵体的形式表达，五株单表位蛋白以可溶性的形式表达。利用亲和层析等层析技术实现了对上述蛋白的高通量纯化。Western blot结果显示，纯化后的所有蛋白都能和FMDV感染阳性血清反应。间接ELISA结果表明3ABC、2C、3Bepi1、3Bepi2蛋白具有良好地区分FMDV感染阳性血清和阴性血清的能力。
　　分别将单独的3ABC蛋白和混合的3ABC和2C蛋白作为包被抗原成功建立了两种检测猪FMDV感染的CLIA方法，即猪-3ABC-CLIA和猪-3ABC-2C-CLIA。通过检测712份已知FMD背景的猪血清表明猪-3ABC-2C-CLIA（诊断敏感性为100％，诊断特异性为96.47％）的准确性要明显高于猪-3ABC-CLIA(诊断敏感性为95.73％，诊断特异性为95.87％)。通过对田间962份样品的检测表明猪-3ABC-2C-CLIA与国产商品化ELISA试剂盒的符合率为96.15％，与进口商品化试剂盒的符合率为97.81％。通过对感染FMDV的猪进行血清学监测表明，在通常情况下，各商品化ELISA试剂盒最早可以在感染后的6d-9d判定猪感染了FMDV，相比之下，猪-3ABC-2C-CLIA在感染后的1 d-4d即可判定猪感染FMDV。此外，该CLIA方法具有检测快速的优点，可在15min内完成检测，并具有良好的重复性与稳定性。
　　在此基础上，成功建立了检测牛口蹄疫非结构蛋白抗体的CLIA方法即牛-3ABC-2C-CLIA。通过检测460份已知FMD背景的牛血清表明该方法诊断敏感性为96.86％、诊断特异性为93.38％。通过对田间810份随机样品的检测表明该CLIA方法与国产ELISA试剂盒的符合率为91.85％与进口ELISA试剂盒的符合率为92.83％。此外该方法可在25min内完成检测。
　　因此，我们首次研发成功了能够快速并敏感地同时检测口蹄疫3ABC、2C非结构蛋白抗体的化学发光免疫分析诊断试剂盒。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 口蹄疫及口蹄疫诊断现状

1．1．1 口蹄疫

1．1．2 口蹄疫诊断现状

1．2 化学发光技术在人兽共患病诊断中的应用

1．2．1 化学发光技术概述

1．2．2 化学发光的原理

1．2．3 发光剂的种类

1．2．4 化学发光最新相关技术

1．2．5 相关人兽共患病化学发光检测方法

1．3 总结与展望

第二章 口蹄疫非结构蛋白3ABC和2C的表达、纯化以及免疫反应性的鉴定

2．1 材料

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 FMDV RNA的提取

2．2．2 引物的设计

2．2．3 2C目的基因的扩增

2．2．4 3ABC全长基因的定点突变和扩增

2．2．5 目的片段与PMD18T载体的连接与测序

2．2．6 转化、摇菌

2．2．7 菌落PCR鉴定并送测序

2．2．8 提取质粒

2．2．9 表达载体与目的片段的酶切、连接

2．2．10 转化、摇菌、菌落PCR鉴定

2．2．11 阳性质粒的小规模诱导表达

2．2．12 蛋白的大规模表达

2．2．13 超声破碎

2．2．14 蛋白纯化

2．2．15 western blot

2．2．16 ELISA

2．3 实验结果

2．3．1 全长3ABC和全长2C目的基因的扩增

2．3．2 3ABC突变结果

2．3．3 蛋白的表达纯化与western blot鉴定

2．3．4 ELISA鉴定融合3ABC与融合2C蛋白的免疫反应性

2．4 讨论

第三章 口蹄疫3A、3B区域表位蛋白的表达、纯化以及免疫反应性的鉴定

3．1 材料

3．1．1 主要试剂及仪器

3．2 方法

3．2．1 表位的选择与基因合成

3．2．2 表达载体的构建

3．2．3 蛋白的诱导表达

3．2．4 蛋白的纯化

3．2．5 Western blot鉴定五组表位蛋白的免疫反应性

3．2．6 ELISA鉴定五组表位蛋白的免疫反应性

3．3 结果

3．3．1 五组表位蛋白的表达、纯化、免疫学鉴定情况

3．4 讨论

第四章 检测猪FMDV感染的化学发光免疫分析方法的建立

4．1 材料

4．1．1 已知背景猪血清样品

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器

4．2 实验方法

4．2．2 3ABC-2C CLIA方法的建立

4．3 实验结果

4．3．2 临界值、诊断敏感性、诊断特异性的判定

4．3．3 分析敏感性的比较

4．3．4 重复性鉴定

4．3．5 稳定性鉴定

4．3．6 比对实验

4．3．7 FMDV感染动物的血清学监测

4．4 讨论

第五章 检测牛FMDV感染的化学发光免疫分析方法的建立

5．1 材料

5．1．1 已知背景牛血清

5．2 方法

5．3 结果

5．3．1 检测条件的确定

5．3．2 临界值、诊断敏感性、特异性的确定

5．3．3 分析敏感性的鉴定

5．3．4 比对实验

5．4 讨论

第六章 全文讨论

第七章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历