EIAV强毒株与疫苗株诱导多种马限制因子表达谱特征及与免疫保护的相关性分析

摘要

马传染性贫血病毒(EIAV)与人免疫缺陷病毒(HIV-1)同属逆转录病毒科慢病毒属，两者具有相似的基因组结构、蛋白种类和功能以及感染和复制方式。上世纪七十至八十年代，哈尔滨兽医研究所沈荣显院士等通过传统的生物致弱方式得到了一株可诱导马属动物产生良好免疫保护的EIAV弱毒疫苗，该疫苗成功地控制了EIAV在中国的流行，也是目前世界上唯一大规模应用的慢病毒疫苗，因此EIAV强弱毒株的评价系统已成为研究慢病毒致病及免疫保护机制的独有模型。
　　天然免疫限制性因子是一类细胞内天然免疫蛋白分子，通过多种机制在病毒复制周期的不同阶段发挥限制作用，成为机体固有免疫防御感染的重要手段。虽然在体外过表达、敲减等功能性放大实验中已证实多种马属限制因子对EIAV复制具有限制作用，但是其在临床中能否发挥抵抗病毒复制而产生免疫保护作用尚未见报道。因此，本研究利用我国特有的EIAV强弱毒株系统，旨在探讨2个问题:1)EIAV强毒株和疫苗株诱导的多种天然免疫因子的表达是否具有差异性;2）限制因子表达的差异性与EIAV感染马体后的临床状态是否相关。
　　为了探讨这些核心问题，本次研究选择了现已报道的对EIAV复制具有限制作用的马属天然免疫限制因子作为检测指标(A3Z3、IFITM3、SAMHD1、SLFN11、TRIM5α、Tetherin和Viperin)，通过荧光定量PCR技术从体外和体内两方面评价了，EIAV强毒株和疫苗株在感染靶细胞和马体后诱导的多种天然免疫限制因子的mRNA水平;并以EIAV疫苗免疫马对强毒株的感染保护为模型，根据攻EIAV强毒后马匹是否发病，将实验马匹分为免疫保护组和未保护组，分析限制因子表达与免疫保护的相关性。结果显示，疫苗株和强毒株体外感染靶细胞后，七种限制因子均上调表达。但与强毒株相比，疫苗株诱导更多的A3Z3、SAMHD1、SLFN11、TRIM5α和Tetherin表达。两毒株感染马体后，疫苗株7种限制因子均上调表达，而强毒株感染马仅A3Z3、IFITM3和Tetherin为上调表达。更为重要的是，在感染早期(1d-5d)，保护组SLFN11、Viperin表达水平显著高于未保护组(p＜0.05）;而在感染晚期(15d-60d)，保护组马匹的A3Z3、SAMHD1、SLFN11、TRIM5α和Viperin表达显著高于未保护组(p＜0.05），且在晚期阶段，SLFN11和Viperin表达量与病毒载量具有负相关性，具有统计学意义(p＜0.001;p＜0.05)。上述结果表明，EIAV强毒株和疫苗株感染靶细胞和马体后免疫限制因子具有不同的表达时相和水平，能持续高表达免疫限制因子的马匹可对强毒攻击产生有效抵抗。该研究结果有助于对EIAV感染和天然免疫的认知，为其致病及免疫保护机制的研究提供数据和参考。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 EIAV的生物学特征

1．1．1 EIAV基因组结构和功能

1．1．2 EIAV的细胞嗜性

1．1．3 EIAV的致病机理

1．2 EIAV疫苗研究进展

1．2．1 国外EIAV疫苗研究进展

1．2．2 我国EIAV弱毒疫苗研究进展

1．3 抗病毒的天然免疫限制因子研究进展

1．4 本研究的目的与意义

第二章 EIAVDLV34与EIAVDLV121诱导体外培养eMDMs多种限制因子表达特征分析

2．1 材料和方法

2．1．1 细胞和病毒株

2．1．2 质粒

2．1．3 主要仪器

2．1．4 主要试剂

2．1．5 引物设计

2．1．6 病毒感染活性的确定

2．1．7 自然沉降法分离eMDMs

2．1．8 接毒、样本采集时间及用途

2．1．9 细胞RNA的提取及反转录

2．1．10 限制因子表达的检测

2．1．11 病毒RNA的提取及反转录

2．1．12 病毒载量的检测

2．1．13 病毒RT酶活性的检测

2．2 结果

2．2．1 Real time PCR标准曲线的建立

2．2．2 eMDMs感染EIAVDLV34和EIAVDLV121后限制因子表达的监测

2．2．3 EIAVDLV34和EIAVDLV121诱导限制因子表达谱的差异比较

2．2．4 EIAVDLV34和EIAVDLV121在eMDMs内的复制动态监测

2．3 小结

第三章 EIAVLN40与EIAVDLV121诱导马体内多种限制因子表达特征分析

3．1 材料和方法

3．1．1 病毒株和实验动物

3．1．3 马PBMCs的分离

3．2 结果

3．2．2 EIAVLN40与EIAVDLV121诱导限制因子表达的差异比较

3．2．3 EIAVLN40和EIAVDLV121感染马后的复制动态监测

3．3 小结

第四章 限制因子表达与免疫保护的相关性分析

4．1 材料和方法

4．1．4 免疫抑制实验与抑制效果的评价

4．1．5 样品的采集及处理

4．2 结果

4．2．1 免疫抑制效果评价

4．2．2 攻毒后实验马的临床体征和病毒载量

4．2．3 攻毒后马限制因子表达的监测

4．2．4 限制因子表达与免疫保护的相关性分析

4．2．5 SLFN11和Viperin表达与病毒载量的相关性分析

4．3 小结

第五章 全文讨论

第六章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历