茶树丙氨酸脱羧酶与丙氨酸氨基转移酶基因的分离鉴定

摘要

氮素是植物生长发育过程中需求量最大的矿质元素，氮素供应不足会严重影响农作物的产量。为了保证产量，现代农业生产过程中往往施用大量氮肥。但是大多数农作物对氮肥的利用率非常低，大量氮肥因流失而造成环境污染。因此借助基因工程手段培育氮高效利用作物品种，成为降低氮肥的施用量、减少环境污染的根本途径。
　　茶树作为叶用作物，其氮素利用率直接影响茶叶产量，选育氮素利用效率高的品种一直是茶树育种工作者的重要目标之一。茶树的氮素吸收利用率主要取决于其吸收、同化以及运输分配到收获器官中的能力。目前茶树中氮素吸收转运与初步同化相关基因已经被克隆。近年来研究发现，氮素同化下游途径中的丙氨酸代谢相关基因，也在氮素的吸收利用中起重要作用。本研究克隆了2个与茶树丙氨酸代谢相关的基因，丙氨酸脱羧酶与丙氨酸氨基转移酶基因，分析了其组织表达特性，并鉴定了相关功能。主要研究结果如下:
　　1.根据茶树转录组数据库中获得的基因序列设计引物，克隆了茶树CL4912基因，并对其进行生物信息学分析。结果表明，CL4912的cDNA全长1716bp，编码478个氨基酸，推导的蛋白分子量为53.6 kD，理论等电点(pI)为5.83。CL4912为稳定的亲水性蛋白，不含跨膜结构和信号肽。
　　2.同源序列搜索与系统进化分析结果显示，CL4912蛋白具有丝氨酸脱羧酶功能。将CL4912蛋白基因进行原核表达，并纯化蛋白检测其催化活性。研究结果显示，该蛋白分子量约为55kD，CL4912蛋白既可以催化丙氨酸脱羧，又可以催化丝氨酸脱羧，且丙氨酸脱羧的活性为丝氨酸脱羧活性的8～10倍，因此将编码该蛋白的基因命名为茶树丙氨酸脱羧酶基因(CsAlaDC)。
　　3.明确了CsAlaDC基因的组织表达特性及其对氮素的响应。结果表明，该基因在茶树一芽二叶、成熟叶和根中均有表达，但是在根系中的表达量极高，为叶片表达量的数百倍。氮素处理后，不同茶树品种的根系中，CsAlaDC基因的表达量，有相似的变化规律，即在短期(24h)内下调表达，在随后较长一段时间内上调表达，处理5天后达到响应最大值，随后表现出下调趋势;但是该基因对氮素响应的强弱，随氮素供应水平和品种的不同而存在一定的差异。
　　4.克隆了茶树丙氨酸氨基转移酶基因（CsAlaAT1），并对其进行生物信息学分析。结果显示，CsAlaAT1的cDNA全长1747 bp，编码541个氨基酸，推导的蛋白分子量为59.4 kD，理论等电点(pI)为5.82。CsAlaAT1为亲水蛋白，不含跨膜结构和信号肽。通过在线序列搜索，发现CsAlaAT1蛋白与其他物种AlaAT蛋白有较高的相似性。亲缘关系分析结果表明，CsAlaAT1与黄瓜AlaAT2亲缘关系最近，推测两者具有相似的生物学功能。
　　5.检测并分析CsAlaAT1基因表达的组织特性及其对氮素的响应。结果显示，该基因在一芽二叶、成熟叶和根系中均有表达，在根中的表达量高于其他两个组织。对CsAlaAT1基因表达对氮素的响应研究表明成熟叶中CsAlaAT1受氮素诱导上调表达，高浓度(1mmolL-1 NH4NO3)氮素的诱导效应比低浓度(0.1 mmolL-1 NH4NO3)氮素诱导效应更强烈;在根中，处理24h后，高氮素诱导CsAlaAT1上调表达，低浓度氮素抑制CsAlaAT1基因的表达。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 植物体内的丙氨酸代谢途径及关键酶

1．1．1 丙氨酸代谢途径

1．1．2 丙氨酸脱羧酶(Alanine decarboxylase，AlaDC)基因研究进展

1．1．3 丙氨酸氨基转移酶基因研究进展

1．2 研究的目的与意义

1．2．2 研究内容与技术路线

第二章 茶树CL4912基因的克隆与功能鉴定

2．1 材料与方法

2．1．3 试验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 茶树叶片总RNA提取结果

2．2．2 基因的克隆与序列分析

2．2．3 多序列比对与系统发生树的构建

2．2．4 亚细胞定位与信号肽预测

2．2．5 高级结构预测

2．2．6 CL4912蛋白的原核表达与纯化

2．2．7 CL4912蛋白的酶活性测定

2．3 讨论

第三章 茶树丙氨酸脱羧酶基因(CsAlaDC)的表达分析

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料及处理

3．1．2 基因的表达分析

3．2 结果与分析

3．2．1 茶树CsAlaDC基因的组织表达特性

3．2．2 茶树CsAlaDC基因表达对氮素的响应

3．3 讨论

第四章 茶树丙氨酸氨基转移酶基因(CsAlaAT1)的克隆与表达分析

4．1 材料与方法

4．2．2 CsAlaAT1基因的生物信息学分析

4．2．3 茶树CsAlaAT1基因的组织表达特性

4．3 讨论

5．1 全文总结

5．2 展望

参考文献

附录

致谢

作者简历